Двойное окрашивание фото: 35 модных образов с фото — septfon.ru

Содержание

Окрашивание волос в два цвета, фото

Последние тенденции в нише окрашивания волос покоряют нас своим вызовом и креативом. Стоит вспомнить моду на седые волосы или розовое золото. Современность убирает шаблоны и если ты чувствуешь, что этот образ твой, долой скучный look. В прошлом году вошло в моду двойное окрашивание волос. Эта техника сразу была замечена среди креативных представителей субкультур и завоевала миллионы сердец в современной моде.
Окрашивание волос в два цвета – означает разделение волос на две равные половины и окраску одной части волос в отличный от другой части тон.

Двойное окрашивание волос белый и темный

На фото: вариант двухцветового окрашивания волос. Белое и черное, инь и янь — креативный подход к преображению своей прически.

Черно-белая комбинация окрашивания – является практически классикой. Такое сочетание цветов хорошо подходит девушкам холодного подтона кожи. Вы преобразитесь в стильную блондинку и брюнетку одновременно.

Альянс белого с темным не является единственным вариантом. Любые сочетания с черным цветом выглядят превосходно. Посоветуйтесь с профессионалом, какие цветам подойдут именно вам, что бы подчеркнуть оттенок кожи и глаз и выгодно оттенить свой образ.

Блонд можно заменить модным сейчас Granny (седой, пепельный) или более сочное сочетание красный (цвет вишни) – отлично сочетается с глубоким черным.

На фото: двойное окрашивание темный и красный цвет.

Варианты окрашивания волос в два цвета.

Смелый вызов в технике окрашивания волос привносит полную свободу и творчество в преображении вашего стиля. Вы можете комбинировать любые цвета и примерять на себя самые креативные варианты. В Split Hair уместен так же горизонтальный градиент с плавным переходом цвета.

Последователи модной техники покраски волос, разделились на два лагеря, одни используют контрастное сочетание цветов, другие, выбирают схожие цвета, с разницей светлого и темного тона.

На фото: певица Мелани Мартинес.

Мелани Мартинес — яркая последовательница экстравагантного стиля окрашивания. У певицы, необычный образ. Каждый раз она предстает перед зрителями, в роли грустной, яркой куклы, часто ей приписывают образ «плаксы». Возможно ее необычная прическа подняла волну моды на двойное окрашивание волос, кто знает. Не редко, знаменитости задают модные течения тому или иному креативному стилю.

На фото: Американская знаменитость Мелани Мартинес и ее необычный стиль волос.

<br />

На фото: смелые варианты синего и фиолетового цвета.Челка окрашенная в два цвета — интересное решение для молодых и смелых девушек.

На фото: прически с косичками и бантом для волос.

Техника Split Hair — выгодно смотрится в различных прическах с косами. Тонкие пряди волос противоположного цвета можно оставить на контрастной половине.

Брюнеткам следует тщательней подготовиться к осветлению волос. Процедура требует обесцвечивания, а затем покраски в блонд. Не забывайте о тщательном уходе за волосами. Здоровые, блестящие волосы всегда ценятся и залог успеха.

Ниже варианты горизонтального или косого окрашивания волос в два цвета.

Модные цвета в Split Hair

Черный

Белый

Пурпурный

Розовое-золото

Красный (вишня)

Бордо

Пепельный

Голубой

Синий

Короткие и средней длины волосы.

Преимущественно, двойное колорирование волос применяется на длинных волосах, но на средних или коротких, так же с успехом можно использовать технику окрашивания с два цвета.

На фото: короткая стрижка черное и белое

Умелое сочетания цветов и виртуозность мастера могут сотворить чудеса в вашем преображении и подать стрижку в выгодном ракурсе. Посмотрите, как используя цветовое решение темного и белого, мастер искусно создал два слоя цвета, которые выгодно смотрятся в короткой стрижке.

Новинки от известных салонов в 2020 году в технике двойного окрашивания:

На фото слева на право: Alfredo Valero & Miriam Mateo — Disutopia, Chaos, XXL — Walkirias

Hooker & Young — School Yearbook \ Felicitas Hair — Why not

Felicitas Hair — Why not \ Marc Antoni — Kaleidescope

Читай еще!

Двойное окрашивание волос: фото

Двойное окрашивание волос является одним из самых популярных методов преображения внешности женщин современности. Существует множество методик и технологий, девушки могут выбрать приближенные к натуральным оттенкам цвета, или же что-то экстравагантное. Балаяж, мелирование, брондирование, деграде, дипдай — это далеко не все, что можно увидеть в предложениях салонов красоты. Познакомимся более конкретно с видами двойного окрашивания, чтобы можно было с уверенностью стилисту рассказать о своих предпочтениях, и не терять ни его, ни свое время на ознакомление с технологиями каждого метода.

Прелесть сочетания двух оттенков

Самый простой способ изменить внешность и украсить себя — окрашивание волос. Многие девушки постоянно экспериментируют, и обычное окрашивание уже надоело практически всем. Двойное окрашивание волос, фото видов которого можно увидеть в этой публикации, полюбилось многим, звезды не перестают экспериментировать со своей внешностью, и удивляют нас своим новым стилем. Девушки, глядя на своих кумиров, стараются соответствовать, окрашиваясь подобным образом. Сочетание оттенков придает женщинам особое очарование, шарм, делает их более интересными и привлекательными, создает уникальный облик. Как уже было написано в начале статьи, имеется множество методик, все они схожи, но разница между ними все же очевидна. Рассмотрим самые модные направления.

Для кого подойдет балаяж?

Данная техника подразумевает мелирование, при котором осветлению подвергаются только кончики волос. Производится данное двойное окрашивание на короткие волосы, или на среднюю длину. На длинных локонах техника будет смотреться не так впечатляюще. Особенно хороша технология для девушек с тонкими или жидкими волосами, такое окрашивание придаст хороший визуальный объем, при котором волосы будут переливаться при попадании на них света.

Техника выполнения

Самостоятельно создать балаяж на волосах совсем не сложно, если у вас короткие волосы. Если же они длинные, то лучше довериться специалисту или выполнять окрашивание самостоятельно, но очень аккуратно и под чутким руководством профессионала.

Для начала локоны необходимо распределить по прядкам так, чтобы у корней образовались участки-квадратики. Пряди зафиксируйте при помощи резинок, чтобы они не распадались в процессе. Далее, разведите светлую краску (блондирующую) и окрасьте кончики, старайтесь не задевать зоны у корней. Чтобы эффект был максимальным, каждую прядь после окрашивания оберните кусочками фольги. Данная методика приемлема для обладательниц длинных локонов.

Работа с короткими или средней длины волосами

Двойное окрашивание балаяж с укороченными локонами производится по следующей схеме. Первым делом необходимо начесать волосы таким образом, чтобы они торчали в разные стороны, и находились в таком положении в процессе всей работы. Если волос слишком мягкий или тонкий, и не сможет устоять долгое время под тяжестью краски, необходимо начес зафиксировать лаком. Распределите локоны на пряди, и, отделяя их друг от друга фольгой, прокрашивайте концы. Можете укладывать локон на кусок фольги, а потом наносить краску. Так поступают профессиональные парикмахеры для того, чтобы уберечь рядом расположенные пряди от «несанкционированного» попадания краски. Данная технология также приемлема, если у вас многоуровневая стрижка.

Деграде: техника выполнения

Этот вид двойного окрашивания приемлем для волос любой длины. Прелесть метода заключается в том, что результатом будут очаровательно переливающиеся волосы, выглядеть окрашивание будет натурально, прическа получит дополнительный визуальный объем. Для работы пригодится две упаковки краски одно цвета, но с различимыми оттенками (2-3 тона).

Двойное окрашивание производится по всей длине волос, пряди чередуются. Эта технология до безумия проста, и ее можно самостоятельно провести в домашних условиях. Если вы хотите получить лишь небольшой эффект, то выбирайте разницу оттенков в два тона. Если же необходимо получить более экстравагантную шевелюру, то подойдет краска, разнящаяся на три оттенка.

Натуральность в образе сегодня все более популярна, и вы можете самостоятельно окраситься, создав неповторимую внешность. Для этого верхние пряди необходимо отделить от нижних, заколоть на макушке головы. После этого окрасьте нижние в более светлый оттенок, промойте, выждав необходимое время, но старайтесь не намочить пряди, что были убраны. Теперь окрашиваются верхние, а по завершении времени выдерживания волосы промываются вместе.

Омбре

Данная технология является излюбленной у многих девушек. Она подходит на волосы и короткие, и длинные. Идеально будет смотреться такое двойное окрашивание на темных волосах. Для этого можно использовать как одинаковые цвета, но разнящиеся по оттенкам, или же выбрать совершенно разные, но сочетаемые. Например, черный будет отменно смотреться с белым, фиолетовым, красным или рыжим. Главное — создание видимости отращенных у корней волос, как будто их уже давно не красили!

Технология окрашивания

Для создания обмре необходимо окрасить волосы полностью, но разграничивая цвета. Корни и около 20 сантиметров от них (в зависимости от длины, мы привели пример для длинных локонов) нужно окрасить в более темный цвет, а оставшуюся часть волос — тот, что светлее. Двойное окрашивание должно производиться плавно, чтобы не было прямой полосы на границе между оттенками.

Частичное колорирование

Это технология двойного окрашивания со светлым и темным оттенком, с сильно разнящимися, но сочетаемыми цветами для придания многоуровневой стрижке исключительной уникальности, для акцентирования отдельных элементов прически. Подойдет для ассиметричных стрижек, также идеально частичное колорирование для подчеркивания глаз, скул или других черт лица. Что окрашивать — решать только вам, можете выделить кончики волос, челку или же отдельную прядь.

Брондирование

Название технологии очень точно отображает получаемый результат. Слово «брондирование» произошло от двух английских слов, которые в переводе звучат, как «Коричневый» и «Светлый», то есть методика подразумевает только это использование цветов. Смотрится такое двойное окрашивание очень естественно, кажется, что волосы просто выгорели на солнышке. Эффект смеси из расплавленного золота и меда, растекшейся по волосам, выглядит просто потрясающе. Локоны будут сиять при любом световом блике, прическа визуально выглядеть станет более объемно.

Цель данного метода заключается в максимальном осветлении локонов, придания им натуральности, блеска и очарования.

Брондирование является одним из самых сложных по технике выполнения методом. Чтобы окраситься, необходимо обратиться к специалисту. Он профессионально распределит все локоны на темные и светлые по готовой схеме окрашивания. Также мастер сможет подобрать идеальные оттенки для каждого типа лица, отталкиваясь на цвет кожи, глаз, черты лица, длину локонов и структуру стрижки. При необходимости парикмахер предложит подкорректировать прическу, чтобы двойное окрашивание (фото имеется в данной статье) смотрелось как можно выгодней.

Американское колорирование

Его еще называют просто двойным колорированием, оно понравится всем экстравагантным модницам. Такую технологию выбирают самые яркие представительницы, желающие отличаться от всех остальных представительниц прекрасного пола. Название свое это двойное окрашивание получило из-за необычайной популярности у американских панк и рок-звезд, которые всегда должны выглядеть максимально ярко и броско.

Суть окрашивания заключается в отборе среди общей массы волос одной, или нескольких прядок, которые окрашиваются в яркие цвета: красный, зеленый, синий, фиолетовый, и прочие. Смотреться американское колорирование будет выигрышно на локонах любой длины и любого цвета. Если натуральные волосы имеют темный оттенок, то перед процедурой создания неповторимого образа пряди, которые будут выделены, обесцвечиваются.

Произвести такое двойное окрашивание самостоятельно вполне возможно. Сейчас самые модные цвета для отдельных прядей — это все оттенки красного, рыжего, фиолетовый, синий, пурпурный, цвет морской водоросли, зеленки, розовый.

Заключение

Выбрав одну из методик, не торопитесь самостоятельно окрашиваться: для первого раза лучше воспользоваться услугами профессионала. Понаблюдайте, как он производит окрашивание, а потом уже экспериментируйте самостоятельно.

Стоит помнить, что окрашенные волосы нуждаются в особом уходе. О том, как сделать маски для волос самостоятельно, какие самые действенные, можете прочесть в других статьях нашего сайта.

Покраска волос в два цвета: 75 фото

А ты любишь эксперименты? Уверены, что ты уже заглядывалась на волосы двух цветов. Почему бы и не попробовать? Сейчас, когда наступили пасмурные деньки, это очень актуально. Внимание и восхищенные взгляды тебе точно обеспечены!

Покраска волос в два цвета. Зачем?

А затем, что твой образ сразу станет уникальным. Ты добавишь своим волосам глубину и визуально сделаешь их гуще. Ты можешь экспериментировать с цветами, подчеркивая свою индивидуальность. Ты еще не решилась?

Как выбрать свой цвет

Первое, на что стоит обратить внимание – это контраст цветов.

Второе, выбирай цвета из одной цветовой гаммы, холодные оттенки сочетай с холодными и наоборот.

Третье, учти тон кожи!

Четвертое, если ты хочешь добиться естественных оттенков волос, то выбирай цвет ближе к своему «родному».

Пятое, не бойся рисковать!

Самые лучшие сочетания двух цветов на наш взгляд

Рыжий/ черный
Платина/ черный
Темный шоколад/ карамельный
Баклажан/ бордовый/ алый/ темно-коричневый
Медный/ каштановый
Фиолетовый/ синий

Покраска волос в два цвета: основные стили

1. Верхний/нижний слои – на данный момент самый популярный прием. В этом случае верхняя часть волос красится в какой-либо светлый цвет, а нижний – в темный. Бывает и наоборот, выбор за тобой!

2. Цветные кончики – обработка контрастным цветом только нескольких сантиметров кончиков. Очень эффектно выглядит на коротких волосах.

3. Выделение прядей или частей прически. Можно поэкспериментировать, выделив прядку, челку, сделать горизонтальные полосы. Дерзай, не ограничивай свою фантазию!

Вариант для смелых

Леди Гага и Ники Минаж (а кто же еще специалист по ярким образам?) предложили публике свой вариант – четкий пробор посередине и окрашивание каждой половины волос в свой цвет. На удивление быстро девушки всего мира подхватили эту идею (обычно прически поп-див так и остаются только их прерогативой).

Покраска волос в два цвета по шагам

Если ты решилась сделать волосы двух цветов самостоятельно, предварительно ознакомься с некоторыми рекомендациями.
1. Обязательно подбери оттенки, подходящие именно тебе. Учти свой стиль в одежде, цветотип, оттенок глаз.
2. Подготовь старую футболку или полотенце (тебе они понадобится для изолирования прядей), вазелин или жирный крем, две краски, шампунь и кондиционер.
3. Раздели волосы на пряди, учитывая способ окрашивания.
4. Закрой части, которые ты будешь окрашивать в темный цвет футболкой, надежно закрепи.
5. Нанеси светлую краску, следуя инструкции. Смой краску и высуши волосы. Важно: дождись, когда волосы высохнут полностью!
6. Закрой уже окрашенные участки и нанеси темный цвет. Воспользуйся кисточкой, чтобы случайно не окрасить светлые волосы, действуй предельно аккуратно!
7. Помой голову обычным способом.
8. Беги к зеркалу любоваться результатом! Только не жди эффекта сразу – все-таки на сухих волосах он будет заметнее.

Покраска волос в два цвета: идеи

Смотри на мир сквозь розовые очки! Или пусть он смотрит на тебя…

Вспомни о классике: черно-белый вариант

Если ты страстная девушка, то этот вариант твой!

И еще варианты. Взгляни, сколько сумасшедших, стильных, безупречно выполненных идей!

© Автор статьи: Татьяна Эбель

Специально для сайта 24hair.ru

Упс ! Страница не найдена !

Коллекция весна-лето

Коллекция осень-зима

Backstage осень-зима

Backstage весна-лето

какой цвет волос в моде (90+ фото)

Женщины любых возрастов всегда стремятся выглядеть не просто привлекательно, а безукоризненно и сногсшибательно. Для создания идеального образа потребуется не только стильная одежда, но и также и не менее стильная и трендовая прическа с удачно подобранным тоном волос.

Как известно, еще с древних времен представительницы прекрасного пола любили экспериментировать с цветом своих волос, однако современная мода шагнула гораздо дальше вперед.

Так, например, последние несколько лет, помимо основных и привычных для окружающих оттенков натуральной палитры, стали невероятно востребованными яркие и экстравагантные оттенки, такие как зеленый, лиловый и розовый. Стоит отметить, что данная тенденция хоть и появилась несколько лет назад, тем не менее, еще популярность возрастает с каждым годом.

Модное окрашивание волос 2021-2022 в темные оттенки: фото-идеи

Если говорить о модных тенденциях окрашивания в 2021-2022 году, то можно отметить что, не актуальных оттенков как таковых не будет, поскольку большинство стилистов предлагают модницам абсолютную свободу действий.

Но тем не менее, самым горящим трендом по-прежнему останется колорирование волос модными яркими оттенками. И если ранее такой вид окрашивания могли себе позволить предпочтительно «светлые головы», то в этом сезоне настоящим хитом станут яркие розовые или голубые пряди в сочетании с темными оттенками, такими как черный, темный шоколад или мокко.

Довольно распространенным станет так называемое двойное окрашивание, когда внутренняя часть шевелюры окрашена нестандартными трендовыми цветами, такими как лиловый, розовый, зеленый или голубой, а верхняя часть выполнена в приближенном к натуральному оттенку, например темно-каштановый, горячий шоколад, мускатный орех или кофе.

Таким образом, получается что в обычном состоянии за верхним шаром цветных прядей не будет видно. А вот если на такую прическу сделать укладку, то она заиграет новыми, весьма неординарными красками. Можно использовать для окрашивания нижней части как один, так и сразу несколько цветов.

Модные светлые оттенки волос 2021-2022: фото-идеи окрашивания

Любительницы платинового и нордического блонда могут ликовать, поскольку в 2021-2022 году это оттенки по-прежнему останутся трендом номер один в области модного окрашивания. Однако некоторые видоизменения настигнут и их. В связи с динамично развивающейся тенденцией на колористику, хитом сезона станет дополнение блондинистых локонов яркими выразительными прядями необычных тонов, предпочтительно розовыми или лиловыми.

Для тех, кто пока не готов к таким радикальным мерам, существуют и более лояльные виды модного окрашивания, например, популярное уже несколько сезонов подряд светлое омбре. Самой востребованной тенденцией станут темные-русые корни и плавный переход по всей длине к платиновым или нордическим кончикам.

Предпочтительно чтобы переход был мягкий и малозаметный, а основная масса волос имела светло-пепельный оттенок блонда. Также популярным останется и более спокойное омбре с плавным но хорошо выраженным переходом от русых корней до нордического или платинового блонда на кончиках. Что примечательно, блонд должен будет занимать больше 60% всей длины волос.

Ну и последний горящий тренд 2021-2022 года для блондинок, которые стремятся к самовыражению это цветное окрашивание корней. Фаворитами станут лиловые и розовые оттенки в сочетании с ледяным или пепельным блондами. Что примечательно, корни должны быть окрашены не больше чем на 3см, и иметь мягкий плавный переход к основному цвету, не более двух сантиметров.

Модные рыжие оттенки волос: тенденции окрашивания 2021-2022

Настоящим хитом 2021-2022 года станет палитра рыжих тонов. Яркие и нетривиальные огненно рыжие либо медные волосы будут чрезвычайно востребованы среди модниц во всем мире. А потому обладательницы натуральных рыжих оттенков могу воистину насладиться своим необычным цветом и максимально подчеркнуть все его достоинства.

А вот тем, кому не повезло похвастаться натуральными волосами данной палитры, могут смело подобрать себе необходимый оттенок в зависимости от типа внешности и кожи, чтобы выглядеть максимально сексуально и привлекательно. Если натуральный цвет волос темный или приближенный к нему лучше всего использовать для модного окрашивания такие тона как огонь, вулкан, бронза, паприка или медь.

При этом само окрашивание лучше всего выполнить в технике обмре с максимально закрашенной длинной и коротким мягким переходом, либо в технике балаяж, чтобы создать оптимальные переливы цвета. Девушки с более светлыми натуральными волосами, приближенными к блонду, могут выбирать для окрашивания яркие и сочные оттенки красной палитры, либо один из перечисленных выше тонов и применить полную покраску по всей длине, от корней до кончиков.

Модные русые оттенки волос 2021-2022: варианты, фото окрашивания

Оттенки русого уже довольно давно являются лидерами среди всей палитры, по востребованности среди женщин самых разных возрастов. Это и не удивительно, ведь количество русых оттенков весьма обширно и выбор действительно велик, да и на волосах любой структуры они смотрятся шикарно, делая их более живыми и объемными вне зависимости от техники окрашивания.

Особенно актуальной стала русая палитра последние несколько лет в связи тенденцией натуральности и естественности, которая коснулась не только модных подиумов, но и индустрии красоты. Чаще всего русые оттенки используются в сочетании нескольких цветов в таких модных видах окрашивания как омбре, шатуш и балаяж, когда необходимо создать плавный и естественный переход от темных корней к осветленным блондинистым кончикам.

Модное окрашивание техниками омбре, балаяж, шатуш, мелирование

С каждым годом появляется все больше необычных техник окрашивания волос. Особенно востребованными в 2021-2022 году останутся такие техники как балаяж, омбре и шатуш, которые были невероятно актуальными несколько предыдущих сезонов.

Поделиться с друзьями:

Твитнуть

Отправить

Класснуть

Какой цвет волос в моде в 2021-2022 году? Фото-обзор оттенков и техник
Ссылка на основную публикацию

техника двойной окраски и фото

Каждый год в парикмахерское искусство врываются новые смелые идеи, призванные внести свежесть в повседневный женский облик.

Покраска волос в два цвета – это еще один хит моды, позволяющий разнообразить внешний вид, но при этом окраска волос в 2 цвета или двойное окрашивание достаточно несложная техника (глядите на фото).

Предлагаем вам подробнее узнать о ней из нашей статьи, а также определиться с тем, подойдет ли вам этот метод тонирования.

Двухтональное окрашивание волос насчитывает огромное количество различных техник. В него входит и омбре, и балаяж, и даже мелирование. Суть этого вида окрашивания проста и исходит из названия техники – волосы окрашивают в два оттенка, либо же волосы осветляют, чтобы сделать переход цвета от натурального к более светлому, но суть остается та же – прическа состоит из двух тонов.

Техника окрашивания волос в два цвета может иметь и разные способы нанесения краски. Например, в таких видах тонирования как омбре или балаяж. краску наносят преимущественно на нижнюю часть волос, а при колорировании, мелировании и прочих подобных техниках задействуются непосредственно вертикальные пряди.

Окрашивание волос в два тона начинается с выбора метода, по которому будет производиться тонирование. Также необходимо подобрать краску и оттенки, которые будут применяться в двухцветном окрашивании. Чаще всего используют либо осветляющую эмульсию, чтобы сделать высветление естественного оттенка, либо же контрастный цвет.

Двойная покраска волос бывает также очень вызывающей и броской: можно окрасить волосы в такие цвета, как голубой, синий, розовый и фиолетовый. Яркий оттенок может как сочетаться со своим натуральным цветом прядей, так и являться «конкурентом» другого яркого оттенка.

В последнем случае окрашивание волос в 2 цвета будет наиболее трудоемким, ведь сначала необходимо окрасить каждую зону головы в подходящий цвет, а затем добавить второй, чтобы переход при этом между тонами выглядел не грубо и наиболее плавно. Если волосы слишком темные, то сперва их нужно будет еще и осветлить.

Окрашивания волос в два цвета (2016 год особенно богат на необычные цветовые сочетания), способны мигом превратить ваш обыкновенный образ в заметный и незабываемый. Однако стоит отметить, что яркие тона удачно смотрятся лишь на молодых женщинах, женщинам старшего возраста лучше отдать предпочтение плавным и естественным тонам.

Например, отлично смотрится осветление кончиков волос, а также прядей у лица. К тому же, такие варианты окрашивания волос в два цвета визуально сбавляют возраста и омолаживают лицо.

Любая покраска волос в два цвета, фото которой вы уже наверняка подобрали как образец, будет наиболее эффектной, если выполнять ее возьмется опытный мастер. Это особенно касается очень темных волос, ведь перед окрашиванием их необходимо будет предварительно осветлить.

Чтобы удачно прошла покраска черных волос в два цвета, фото желаемого результата лучше показать парикмахеру в салоне до того, как он приступит к процессу окрашивания. Дело в том, что порой бывает невозможно с первого раза достичь желаемого эффекта и есть риск, что салон придется посетить не один, а может даже и не три раза.

То самое, особенно актуальное двойное окрашивание волос, фото белый и темный тон на котором смотрятся особенно эффектно, повторить в реальной жизни на черные от природы волосы будет практически невозможно. Даже долгий и трудоемкий процесс смывки краски и осветления не гарантирует достаточно яркого эффекта от двухтонального окрашивания.

Поэтому, окрашивание черных волос в два цвета рекомендуется выполнять с использованием плавных, не слишком резких оттенков.

Хорошо на темных волосах смотрятся проблески каштановых, темно-русых, золотисто-кофейных тонов.
Удачным может оказаться и колорирование кончиков в более светлый оттенок.

Каждая окраска темных волос в два цвета, фото которой кажутся на первый взгляд такими простыми в исполнении, должна подбираться индивидуально мастером для каждой клиентки. Например, некоторым женщинам совсем не идут холодные, или же, напротив, теплые оттенки. И вполне может оказаться, что долгий процесс окрашивания не стоил затраченных усилий, денег и времени, потому как золотистые локоны на нижней половине волос совсем не красят.

Чтобы избежать таких ошибок, лучше помнить два важных правила:

Доверяйте окрашивание своих темных волос исключительно профессиональному мастеру;.
Не рискуйте и не окрашивайте в два тона свои волосы дома самостоятельно.

Покраска темных волос в два цвета (фото идеальных примеров которой давно наводнили каждый модный сайт) все же возможна и осуществима, несмотря на некоторые сложности из-за насыщенного пигмента черного волоса. Нужно запастись терпением и не спешить нещадно осветлять пряди, а действовать поэтапно. Тогда получится и сохранить здоровье и красоту своих волос, и достичь желаемого эффекта двухтонального окрашивания.

В отличие от брюнеток, светловолосые барышни могут себе позволить больше экспериментов с волосами в двухтональном окрашивании. А если есть опыт покраски своими руками, то не составит особого труда выполнить эту технику и в домашних условиях. Окрашивание волос в два цвета блондинки и русоволосые женщины чаще всего выполняют методами балаяжа, омбре или колорирования.

Окраска волос в 2 цвета особенно эффектно смотрится с так называемой техникой выгоревших прядей. Мастер наносит осветляющую эмульсию на верхнюю часть волос, а также на кончики. Этот метод отдаленно напоминает мелирование, однако выглядит более незаметно и естественно. Нижняя часть волос остается при этом нетронутой и более темной, насыщенной. Не менее популярна и покраска половины волос. Это может быть классическое омбре или балаяж, которые затрагивают исключительно нижнюю часть шевелюры.

Нужно заметить, что двухтональное окрашивание наиболее популярно именно среди светловолосых женщин, ведь окраска волос двумя цветами, фото которого в интернете побуждают отечественных женщин обращаться в салоны красоты, на светлых волосах выполняется очень просто, а эффект получается естественным и очень освежает прическу.

Скрытое окрашивание волос – это техника, при которой нижняя часть шевелюры, незаметная глазу, тонируется в более насыщенный цвет (или же, напротив, осветляется). Именно поэтому такой метод и нарекли незаметным и скрытным, так как он затрагивает непосредственно спрятанную от посторонних глаз часть прически.

Итак, теперь вы уже знаете, как называется покраска волос в два цвета и кому она наиболее идет. Примечательно, что при окрашивании нижнего слоя мастера чаще всего прибегают к контрастным тонам.

Так, блондинкам эту зону обычно тонируют в более темный цвет, а порой – в яркий и необычный.
Русоволосым девушкам такой метод окрашивания поможет визуально сделать прическу более интересной, добавить волосам переливов.

Выглядит окрашивание нижнего слоя волос достаточно броско и заметно, а потому можно сказать, что скрытная покраска – это всего лишь метафора.

Окраска коротких волос в два цвета – это самое рекомендуемое стилистами решение, которое позволяет обыграть любую, даже самую посредственную стрижку. Немаловажно, что при двухтональном окрашивании волосы выглядят более густыми и объемными, а этого порой недостает слишком коротким стрижкам. Простор для фантазии на короткие волосы безграничен – можно окрасить лишь концы прядок, а можно тонировать волосы на два слоя, не хуже смотрится даже четкая линия между двумя оттенками, которая в этом случае выглядит, как продуманное решение парикмахера.

Покраска волос в 2 цвета методом омбре наиболее удачно смотрится на стрижках каре, на бобе, а также на волосах до плеч.
Темный оттенок при окрашивании скрытным методом может визуально сделать лицо более худым, потому появляется возможность не только обновить стрижку, но и скорректировать таким образом овал лица.
Очень стильно смотрится и двойное окрашивание на короткие волосы с применением ярких, кричащих оттенков.

Можно проявить фантазию и смелость, поэкспериментировать с тонами. Но нужно помнить, что как бы хорошо не выглядело в интернете двойное окрашивание волос на фото, всегда следует исходить из своих личных особенностей. Не стоит слепо копировать чужой образ, и уж точно не помешает перед радикальной сменой имиджа получить консультацию хорошего мастера. И тогда ваша покраска волос в два цвета принесет вам только позитивные эмоции и положительные перемены во внешнем облике.

Прически светлый верх темный низ

Полное собрание материалов: «прически светлый верх темный низ» для вас и ваших друзей.

Светлые и темные волосы (60 фото) – как выбрать между ними

Природа редко ошибается, создавая человека с определенным тоном кожи и волос, цветом глаз. Как правило, они идеально сочетаются друг с другом. Но стремление к переменам свойственно почти любому человеку, особенно женщинам: они редко довольствуются тем, чем наградила их природа, и постоянно экспериментируют с собственной внешностью.

Один из самых актуальных вопросов для многих из них – светлый или темный цвет волос выбрать при окрашивании?

Идеальный цвет волос – свой для каждой девушки

Критерии выбора

За оттенок волос и кожи отвечает природный пигмент меланин. Чем выше его концентрация, тем более смуглым и темноволосым будет человек. Наверняка вы замечали, что у натуральных блондинок и кожа светлая, а у брюнеток – смуглая или с оливковым оттенком.

Цветотип внешности определяется наследственными факторами

Если спросить у стилистов, по какому принципу они выбирают краску для волос для своих клиентов, они ответят: по цветотипу внешности. То есть, в соответствии с тем, что задумала природа, но для придания большей яркости и выразительности образу можно делать натуральный цвет на пару тонов светлее или темнее.

Эта инструкция особенно актуальна в наши дни, когда модной становится не эксцентричность и яркость, а природная естественность образа.

Кому пойдут темные тона

Такие цвета пойдут тем, у кого волосы от природы также темные или русые. Последние часто имеют невзрачный серый оттенок и, сделав его на один-два тона темнее, можно получить отличный результат.
Покраска волос из светлого в темный тоже возможна, но при этом особое внимание нужно обратить на «температуру» оттенка: холодный или теплый. Он должен соответствовать вашему цветотипу и тону кожи. Если он холодный, вам пойдут такие цвета, как баклажан, иссиня-черный, ледяной каштан. Если теплый – краска с медным, красноватым, медовым отливом.

Идеальное сочетание теплых тонов

Темный цвет волос больше, чем светлый, идет обладательницам карих или зеленых глаз, делая их более яркими и выразительными.

Обратите внимание. Если ваш натуральный цвет – светлый, то после окрашивания вам придется очень часто подкрашивать отрастающие корни. Дело в том, что светлые корни на темных волосах создают эффект проплешин, что смотрится очень некрасиво.

У темной шевелюры множество преимуществ: она выглядит гуще, позволяет делать более смелый макияж, требует меньшего ухода, чем светлые локоны. Да и перекраситься из блондинки в брюнетку намного проще, чем наоборот.

Кому пойдут светлые тона

Блондинки привлекают особое внимание противоположного пола. Видимо, светлый цвет волос ассоциируется с молодостью, незащищенностью, некоторой наивностью, и вызывает желание «взять под крыло». Если вас устраивает такое отношение – смело меняйте стиль.

Но при этом нужно помнить о следующих вещах:

Оттенок должен гармонировать с цветом кожи. Если она очень бледная, с синеватым отливом, вам пойдут холодные серебристые и пепельные тона. Если смуглая или розовая – теплые рыжеватые, песочные, карамельные и т. д.

Компьютерная «примерка» нового цвета поможет вам сделать правильный выбор

Переход из темного цвета волос в светлый должен быть постепенным, если вы не хотите навредить им. Обесцвечивание сильно пересушивает шевелюру, разрушает структуру волоса, ослабляет его. Самый щадящий способ превратиться из брюнетки в блондинку – осветляться на пару тонов за один подход.
При перекрашивании темных локонов в светлые своими руками очень трудно добиться нужного цвета. Нередко они приобретают непредсказуемый оттенок – рыжий или зеленоватый, избавиться от которого будет непросто. Поэтому перед тем, как сделать темные волосы светлее, получите консультацию мастера, а ещё лучше – доверьтесь его рукам.

Совет. Чтобы кардинально изменить внешность, не обязательно полностью перекрашивать волосы. Попробуйте мелирование, оно не оказывает такого негативного влияния, как общее обесцвечивание, а смотреться может намного эффектнее.

Из всего сказанного можно сделать вывод, что важен не столько сам цвет, сколько его оттенок и его сочетание с кожей и глазами. Например, девушкам с серыми или голубыми глазами идут холодные тона (жемчужный, пепельный, серебристый), а кареглазкам и зеленоглазкам – теплые (коричневый, пшеничный, янтарный).

Советы тем, кто решил кардинально изменить цвет волос

О том, что для вашей шевелюры очень вредно резкое изменение колора, уже было сказано. В случае неудачи это не только ослабит их и превратит в подобие соломы, но и может привести к возникновению других сложно решаемых проблем.

Поэтому повторим ещё раз: меняйте цвет не более, чем на 2-3 тона за один прием, особенно в сторону осветления, так как из темных волос сделать светлые намного сложнее.

И ещё несколько советов:

Радикальный цвет (очень темный либо очень светлый) подчеркивает все недостатки кожи, привлекает внимание к её дефектам – пигментным пятнам, прыщикам, кругам под глазами.
Если у вас много седины, лучше сделать выбор в пользу более светлых оттенков – они выглядят естественнее, особенно при отрастании корней, и реже требуют подкрашивания.

Седина может быть красивой

Не забывайте подкрашивать и брови: светлые волосы и темные брови (или наоборот) часто смотрятся не натурально, выдавая ваш маленький секрет.
Покупая краску, обращайте внимание не на изображение модели на упаковке, а на код и название тона, образцы прядей.
Сомневаясь в выборе цвета и в том, пойдет ли он вам, приобретайте красители с невысокой стойкостью – оттеночные шампуни для волос, тонирующие средства. Они позволят вам «примерить» новый образ.

Обратите внимание. Такие средства быстро смываются после мытья головы, что в данном случае можно считать плюсом. Но они могут пачкать постельное белье и полотенца, а также одежду, если вы попадете под дождь.

Убедившись в правильности выбора, для долгосрочного окрашивания покупайте только качественную дорогую краску. Её высокая цена с лихвой окупится стойкостью цвета и меньшим вредом для волос, которые не придется лечить после процедуры.

Окрашивание в стиле омбре

В последние годы все чаще можно встретить девушек, локоны которых окрашены в два цвета, с плавным переходом из одного в другой. Если вы спросите, как называется темные корни и светлые волосы или наоборот, стилисты ответят: это и есть омбре – модное окрашивание, позволяющее достичь естественного эффекта выгоревших на солнце волос и визуально большего их объема.

На этом фото омбре со светлым верхом и темным низом

Помимо этого у данного способа есть и другие достоинства и преимущества:

Это возможность изменить облик, не перекрашивая для этого весь объем волос. Можно сохранить свой натуральный цвет, но светлые концы на темных волосах сделают ваш образ более ярким и выразительным и без кардинальных решений.
Осветлив пряди, обрамляющие лицо, его визуально можно сделать более вытянутым, что особенно оценят круглолицые или полные девушки.
Если правильно подобрать краску, то можно долго не переживать из-за отрастающих корней. Например, когда у брюнетки волосы сверху темные снизу светлые, переход оттенков от корней к окрашенным зонам практически не заметен и смотрится вполне естественно.

Волосы с темным верхом светлым низом выглядят объемно и очень естественно

Этот метод подойдет тем, кто хочет вернуть свой натуральный цвет волос после окрашивания. В процессе отращивания подкрашивать придется только кончики, а плавный переход цвета всегда будет смотреться эффектно.

Заключение

Достаточно лишь слегка изменить цвет волос, чтобы почувствовать себя более привлекательной. Если же вы решились на радикальные перемены, не торопитесь: посоветуйтесь со своим мастером, посмотрите видео в этой статье и подумайте, стоит ли подвергать шевелюру столь серьезным испытаниям.

Возможно, достаточно будет сделать мелирование или брондирование, окрасив только кончики или некоторые пряди, чтобы освежить образ.

Окрашивание в два цвета — 116 фото новинок

Приходит момент, когда обычное изменение оттенка волос надоело и хочется чего-нибудь нового. Поэтому для смелых экспериментаторш стилисты придумали оригинальную технологию – окрашивание в два цвета. В кратком обзоре мы постараемся полностью охватить тонкости необычной процедуры.

Виды окрашивания

Еще сотню лет назад окрашивание волос несло чисто маскирующую функцию: благодаря несложным составам, люди ненадолго избавлялись от седины.

Хотите узнать все о технике окрашивания волос шатуш, вуаля

Современные технологии вывели процедуру на новый уровень. Теперь при помощи красок получают шикарный оттенок или кардинально меняют имидж.

В настоящее время существует несколько популярных видов окрашивания в два цвета.

Брондирование. В последние пару лет эта технология получила огромную популярность среди голливудских знаменитостей. В основе – бежевые или золотисто-шоколадные оттенки. В отличие от первого метода, брондирование выполняется без резких контрастных переходов, все цвета сочетаются друг с другом и с волосами модницы.
Шатуш. Достаточно удачная технология, благодаря которой получается имитировать натуральное выгорание волос с бликами солнца. Пряди окрашиваются в случайном порядке, что добавляет шевелюре объем.
Балеяж. В чем-то похож на омбре и шатуш, но осветление кончиков более естественное, без резких контрастов и переходов.
Мажимеш. Довольно популярное щадящее окрашивание, при котором используют средства без агрессивных веществ. Краски быстро смываются, но не наносят вреда локонам. Такая технология рекомендуется барышням, бережно относящихся к своей шевелюре.
Частичное окрашивание. Иногда достаточно акцентировать внимание на челке или отдельной пряди, чтобы кардинально изменить образ. Мастера используют как радикальные цветовые гаммы, так и близкие к натуральным тонам модницы.
Объемное колорирование. Достаточно сложная процедура, которая требует от мастера максимум профессионализма. Если все предыдущие технологии можно попытаться повторить в домашних условиях, то 3D окрашивание делается исключительно в салоне. Особенности методики – это использование нескольких оттенков одного цвета. Волосы приобретают какой-то волшебный, натуральный блеск. Даже самые тонкие локоны получают долгожданный объем.

Опытные мастера советуют красавицам не пытаться самостоятельно окрасить волосы в два цвета. Дело в том, что даже использование специализированных красителей не даст желаемый результат. Лучше не портить настроение, а обратиться к профессионалам.

Двухцветное окрашивание для коротких волос

Короткие волосы – это отличный плацдарм, на котором модницы быстро и результативно проверяют последние новинки в области парикмахерского искусства. Даже самую простую стрижку можно превратить в оригинальный тренд при помощи удачного сочетания или контраста цветов.

Итак, любимая многими красавицами прическа пикси кардинально видоизменяется, если пряди или челку выкрасить в яркий цвет. Например, сочетание модного в 2017 году желтого и оранжевого акцентирует внимание на глазах и делает обладательницу стрижки по-детски милой. Более смелые красотки могут выкрасить затылок в трендовый оттенок, а верхнюю часть оставить натуральной.

Короткое каре или боб рекомендуется мелировать. Небольшие контрастные пряди отлично смотрятся на прямых волосах. Яркие, необычные оттенки добавят образу более бунтарских дух и понравятся молоденьким красоткам.

О модных локонах 2017 читайте здесь.

Чтобы не отпугнуть мужчину примите к сведению информацию, выложенную в статье : «10 причесок, которые отпугивают мужчин»

Помните: женщинам в возрасте стоит удержаться от окрашивания в броские тона, так как моментально прибавляются лишние годы.

Покраска волос в два цвета: 75 фото

Покраска волос в два цвета. Зачем?

Как выбрать свой цвет

Первое, на что стоит обратить внимание – это контраст цветов.

Второе, выбирай цвета из одной цветовой гаммы, холодные оттенки сочетай с холодными и наоборот.

Третье, учти тон кожи!

Четвертое, если ты хочешь добиться естественных оттенков волос, то выбирай цвет ближе к своему «родному».

Пятое, не бойся рисковать!

Самые лучшие сочетания двух цветов на наш взгляд

Темный шоколад/ карамельный

Баклажан/ бордовый/ алый/ темно-коричневый

Покраска волос в два цвета: основные стили

Вариант для смелых

Покраска волос в два цвета по шагам

Если ты решилась сделать волосы двух цветов самостоятельно, предварительно ознакомься с некоторыми рекомендациями.

1. Обязательно подбери оттенки, подходящие именно тебе. Учти свой стиль в одежде, цветотип, оттенок глаз.

2. Подготовь старую футболку или полотенце (тебе они понадобится для изолирования прядей), вазелин или жирный крем, две краски, шампунь и кондиционер.

3. Раздели волосы на пряди, учитывая способ окрашивания.

4. Закрой части, которые ты будешь окрашивать в темный цвет футболкой, надежно закрепи.

5. Нанеси светлую краску, следуя инструкции. Смой краску и высуши волосы. Важно: дождись, когда волосы высохнут полностью!

6. Закрой уже окрашенные участки и нанеси темный цвет. Воспользуйся кисточкой, чтобы случайно не окрасить светлые волосы, действуй предельно аккуратно!

7. Помой голову обычным способом.

8. Беги к зеркалу любоваться результатом! Только не жди эффекта сразу – все-таки на сухих волосах он будет заметнее.

Покраска волос в два цвета: идеи

Смотри на мир сквозь розовые очки! Или пусть он смотрит на тебя…

Вспомни о классике: черно-белый вариант

Если ты страстная девушка, то этот вариант твой!

И еще варианты. Взгляни, сколько сумасшедших, стильных, безупречно выполненных идей!

Окрашивание волос в два цвета — 13 лучших вариантов

Окрашивание волос в два цвета – это одна из последних тенденций, которая пользуется огромным спросом среди современных модниц. Данная технология представлена массой самых разных вариаций, поэтому вам наверняка будет из чего выбрать.

Преимущества двойной покраски

Двойная покраска приобрела широкую популярность в силу своих преимуществ:

За счет переходов цвета увеличивает объем и пышность редких волос;
Считается щадящей и наносит меньший вред;
Освежает образ и делает женщину привлекательнее и моложе;
Если выбрать естественные оттенки, корни не будут бросаться в глаза. Это позволит сэкономить время и средства, потраченные на поход к парикмахеру;
Является универсальной – двойное окрашивание одинаково хорошо смотрится на дамах всех возрастов и прядях любой длины, густоты или текстуры;
Отличается большим разнообразием, из которого каждая из вас сможет подобрать подходящий вариант.

Специалисты выделяют такие виды окраски волос двумя цветами.

Эта покраска пользуется огромной популярностью не только у голливудских звезд, но и у обычных женщин. Брондирование (blond + brown), сочетающее в себе шоколадные и золотистые нотки, выглядит очень природно и идеально подходит для брюнеток и шатенок. Как и принято в современной парикмахерской моде, его выполняют без резких и контрастных переходов. Еще одним важным условием является гармоничное сочетание применяемых оттенков не только друг с другом, но и с естественным цветом.

О видах брондирования читайте в этой статье.

Шатуш – невероятно красивая техника, имитирующая натуральное выгорание шевелюры. Базовый оттенок прядей – насыщенный и глубокий, дополнительный цвет – светлый, играющий на контрасте. Пряди для такой покраски отбирают в произвольном порядке, что придает волосам невероятный объем и отменный внешний вид. При этом от корневой зоны отступают пару сантиметров, что положительно сказывается на здоровье шевелюры. Шатуш идеально ложится как на длинные, так и на короткие волосы.

Как видно на этих фото, балаяж предусматривает окрашивание кончиков волос и челки с помощью другого цвета. В классическом варианте – за счет светлого оттенка, близкого к родному тону. Для более смелых женщин можно подобрать оттенки яркой и контрастной гаммы – фиолетовый, зеленый, красный, розовый и синий. Эту технику легко воспроизвести в условиях дома. Главное – не передержать краску, иначе придется срезать пережженные концы.

Еще один вид щадящего окрашивания, для выполнения которого используются средства без агрессивных компонентов. Мажимеш – это лучший вариант для блондинок, которые бережно относятся к своей шевелюре. Для покраски применяют натуральные тона, хорошо сочетающиеся с родным цветом волос.

Частичная или зональная покраска

Частичное двойное окрашивание позволяет сделать акцент на кончиках, челке или же отдельных зонах. Это прекрасный способ внести нотки новизны, не меняя кардинально цвет собственной шевелюры. Для зонального окрашивания применяют как натуральные, так и контрастные оттенки.

Мелирование знакомо абсолютно всем современным модницам — его часто применяют женщины всех возрастов. Суть этого метода заключается в окрашивании отдельных тонких прядей в цвета светлой палитры. При этом новый оттенок может как сочетаться с исходным, так и кардинально от него отличаться. Мелирование двумя цветами выполняют и на светлую, и на темную шевелюру, поэтому данная техника по праву считается универсальной.

Модные варианты окрашивания нынешнего сезона не могут обойтись без колорирования. Для этой техники характерно разделение волос на мелкие пряди и дальнейшую покраску их в различные цвета. Граница между тонами может быть как очень мягкой, так и хорошо заметной.

Технологию окрашивания, при котором верх светлый, а низ темный или же наоборот, называют омбре или поперечным колорированием. Омбре бывает трех видов:

Классическое. В классическом варианте ему свойственен эффект хорошо отросших корней, окрашенных в темных цвет, и осветленных концов — темный верх и светлый низ;
Яркое. Для смелых и дерзких дам идеально подойдет креативное омбре, предполагающее использование ярких цветов – розовых, рыжих, зеленых, красных, синих и др.;
«Конский хвост». Отлично смотрится на длинноволосых женщинах, обожающих хвосты. Эффект будет точно таким же, как и при традиционном окрашивании – это плавный переход от темной корневой зоны к высветленным концам. Единственное отличие – линия окрашивания должна проходить на уровне резинки.

Также есть варианты, при которых граница между двумя оттенками проходит по диагонали или же другой оттенок наносится полосой. Границу между тонами растушевывают кистью или же делают четкой. Поперечное колорирование доступно для выполнения в домашних условиях, ведь для этой процедуры не нужны какие-то особые парикмахерские навыки. Что интересно, для омбре не существует четких правил, что позволяет проводить самые разные эксперименты с собственной внешностью.

При таком типе двухцветного окрашивания, который лучше всего смотрится на черных волосах, тонируют лишь концы. Для этой технологии применяют самые разные цвета – как яркие, так и натуральные. Цветные кончики замечательно выглядят на стрижках любой длины – длинных, средних и коротких.

Советы, которые помогут Вам сделать колорирование волос самостоятельно:

Технология, предполагающая разделение шевелюры на две части и покраску их в различные оттенки, называется split окрашиванием. К нему прибегают звезды (Леди Гага, Ники Минаж) и обычные девчонки, которым хочется яркости и разнообразия. Граница между цветами может проходить вертикально (по пробору) или вертикально.

По мнению специалистов лучшими сочетаниями являются:

Черный/рыжий;
Черный/белый;
Карамельный/темный шоколад;
Синий/фиолетовый;
Каштановый/медный;
Алый/баклажан/бордовый/темно-коричневый.

3D–окрашивание или объемное колорирование

Для данной техники характерно применение как темной, так светлой палитры. При этом разница между оттенками должна оставаться максимально размытой и практически незаметной. Благодаря такому решению можно добавить укладке неповторимый объем. Выполнять эту сложную покраску необходимо в салоне – сделать ее самой себе у вас вряд ли получится.

Колорирование широкими прядями

Колорирование двумя цветами является современным аналогом мелирования, при котором для покраски отбираются достаточно широкие пряди. Для получения натурального эффекта советуем остановиться на естественной палитре. Для любительниц эпатажа больше подойдут красочные контрастные цвета.

Выглядит очень красиво и довольно необычно. Главным условием для трафаретной техники являются идеально гладкие и прямые волосы. К сожалению, на кудрях и вьющихся волосах эффект будет незаметен. Специалисты утверждают, что проведение трафаретной покраски требует огромного опыта, поэтому доверять его можно только специалистам. Но многие девушки с удовольствием делают его своими руками, используя специальный шаблон и смывающиеся красители (мелки, спреи или гели).

Если хотите улучшить состояние своих волос, особое внимание стоит уделить шампуням, которые вы используете. Пугающая цифра – в 96% шампуней популярных марок находятся компоненты, отравляющие наш организм. Основные вещества, из-за которых все беды, на этикетках обозначаются как sodium lauryl sulfate, sodium laureth sulfate, coco sulfate, PEG. Эти химические компоненты разрушают структуру локонов, волосы становятся ломкими, теряют упругость и силу, цвет тускнеет. Но самое страшное то, что эта гадость попадает в печень, сердце, легкие, накапливается в органах и может вызывать онкологические заболевания. Мы советуем отказаться от использования средств, в которых находится данная химия. Недавно эксперты нашей редакции провели анализ безсульфатных шампуней, где первое место заняли средства от компании Mulsan Сosmetic. Единственный производитель полностью натуральной косметики. Вся продукция производятся под строгим контролем качества и систем сертификации. Рекомендуем к посещению официальный интернет-магазин mulsan.ru Если сомневаетесь в натуральности вашей косметики, проверьте срок годности, он не должен превышать одного года хранения.

Как выбрать тип двухцветного окрашивания – полезные советы

При выборе окрашивания волос в два цвета необходимо учесть несколько важных советов.

Совет 1. В зрелом возрасте лучше избегать чересчур ярких цветов. Помните, контрастные оттенки лишь подчеркивают возраст.

Совет 2. Брондирование одинаково хорошо подходит как прямым, так и волнистым волосам – в этом нет абсолютно никаких ограничений. К тому же эта техника хорошо структурирует прическу, подчеркивает скулы и освежает цвет лица, что наверняка понравится обладательницам бледной или слишком тусклой кожи.

Совет 3. Делая омбре на прямой шевелюре, будьте крайне осторожны, ведь на гладкой шевелюре видна каждая оплошность. При вьющихся волосах подобных проблем не будет – локоны скроют нюансы.

Совет 4. Мелирование прекрасно смотрится на смуглых женщинах, так как просто идеально оттеняет легкий загар.

Совет 5. На средние волосы, не отличающиеся особой густотой, лучше не наносить контрастные оттенки. В этом случае стоит остановиться на шатуш, плавном брондировании или 3D-окрашивании. Они добавят объем.

Совет 6. Чем плавнее переходы и естественней оттенки, тем моложе будет облик.

Совет 7. Для редких и тонких прядей советуют выбирать мягкий натуральный тон, который и обеспечит дополнительную пышность. А вот контрастный переход не в состоянии дать такого эффекта, поэтому их можно применять только на густой шевелюре.

Совет 8. Сделав двойное окрашивание на каре, вы сможете подчеркнуть скулы, губы и глаза.

Совет 9. При выборе тона краски учтите свой цветотип (цвет глаз, кожи и волос).

Совет 10. Чтобы обеспечить получение чистых оттенков и легко прокрасить только один конкретный участок, воспользуйтесь фольгой или специальной пластиковой косынкой.

Как покрасить волосы в домашних условиях?

Эта подробная схема позволит покрасить пряди в два цвета без помощи мастеров.

Шаг 1. Подготовьте все необходимое для окрашивания:

Шаг 2. Отделите те области или пряди, которые собираетесь красить. Для удобства закрепите их зажимами.

Шаг 3. Если волосы темные, их придется предварительно осветлить. Для этого приготовьте состав по инструкции, описанной на упаковке, нанесите его на волосы, выждите нужное время и промойте теплой водой. Чтобы не испачкать остальную шевелюру, подложите под пряди кусочки фольги.

Шаг 4. Приготовьте красящий состав и выполните двухцветное тонирование осветленных волос. Нанесите его на пряди и убедитесь, что краска распределена равномерно и правильно.

Шаг 5. Выждите около 20 минут и промойте водой с шампунем.

Шаг 6. Воспользуйтесь бальзамом.

Важно! Чтобы не ошибиться с сочетанием оттенков, купите готовый набор или подберите два оттенка из одной линейки одного и того же производителя. Они могут быть светлее или темнее исходного цвета прядей не больше, чем на 3 тона.

Смотрите также: Как сделать классическое мелирование волос (видео)

Оценка 4.3 проголосовавших: 7

Virtual Double Staining с Visiopharm

Virtual Double Staining с Visiopharm — Простое, надежное и автоматизированное разделение

VirtualDoubleSading ™

Избегайте трудоемкого ручного выделения областей опухоли.

Загружая видео, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности Vimeo.
Узнать больше

Загрузить видео

Всегда разблокировать Vimeo

Улучшите результаты анализа изображений с помощью Visiopharm

Запросить демо

VirtualDoubleSading ™

VirtualDoubleStain ™ — это новый и запатентованный метод автоматизированного, надежного и поддающегося проверке разделения опухоли / стромы.Он может быть основан как на ручном обводке, так и на полностью автоматизированном количественном анализе изображений. Этот метод был разработан и утвержден в сотрудничестве с NordiQC и тщательно протестирован в практических клинических условиях в основных диагностических лабораториях по всей Европе.

Виртуальное тройное окрашивание
Слайд онкомаркера можно виртуально выровнять с двумя дополнительными слайдами, создавая сэндвич вокруг опухолевого маркера. Виртуальное тройное окрашивание позволяет анализировать еще больше биомаркеров, давая вам более полную картину микросреды опухоли.

Уверенность в своих клинических решениях

Важные клинические решения принимаются патологами на основе оценки биомаркеров. Хорошо известно, что существует значительная вариабельность внутри и между читателями, связанная с диагностическим считыванием и интерпретацией экспрессии биомаркеров. Существует острая необходимость уменьшить или устранить этот тип вариабельности для биомаркеров, которые будут использоваться в качестве прогностических и прогностических маркеров. Данные из тысяч образцов тканей подтверждают, что анализ изображений для обнаружения области опухоли в сочетании с количественной оценкой экспрессии биомаркеров обеспечивает значительное улучшение как воспроизводимости, так и точности.

Успех

Ваше сообщение было успешно отправлено!

Предпочтение конфиденциальности

Essential
Маркетинг
Внешние СМИ

Печенье

Visiopharm A / S использует файлы cookie, в том числе сторонние файлы cookie, для улучшения взаимодействия с пользователем на нашем веб-сайте за счет защиты функций, создания статистики и сохранения ваших предпочтений в маркетинговых целях.Нажимая «Принять все», вы соглашаетесь на использование файлов cookie для этих целей. Вы можете выбрать, какие категории файлов cookie вы хотите разрешить. Обратите внимание, что в зависимости от выбранных вами настроек некоторые функции на нашем веб-сайте могут быть вам недоступны.

Имя	Borlabs Cookie
Провайдер	Владелец сайта
Назначение	Сохраняет предпочтения посетителей, выбранные в поле Cookie Borlabs Cookie.
Имя файла cookie	Борлабс-печенье
Срок действия cookie	1 год

при поддержке Borlabs Cookie

Политика конфиденциальности

Обработка изображений в цифровой патологии: возможность решить межпартийную вариабельность иммуногистохимического окрашивания

Обзор методологии

ТМА — широко используемая гистологическая технология, при которой небольшие образцы, a.к.а. ядра, извлекаются из различных залитых парафином тканевых блоков с помощью иглы и вставляются в новый парафиновый блок. Таким образом, срез TMA позволяет проводить анализ IHC сразу нескольких образцов ткани. Последующая визуализация срезов позволяет извлекать распределения данных, характеризующие эксперимент или серию IHC. В нашей методологии срез эталонного ТМА включается в каждую серию ИГХ, чтобы обеспечить сопоставимые эталоны окрашивания (см. Дополнительный рис. S1a – d). После оцифровки с 20-кратным увеличением изображения TMA используются для предоставления различных наборов данных:

Для установления разложения по слепому цвету для каждого пакета IHC;
Для статистической характеристики возможных вариаций между партиями и, таким образом, оценки потребности в нормализации изображения;
Для выбора наилучшего способа нормализации изображений IHC, если это необходимо;
Для определения преобразований, необходимых для нормализации полной серии изображений IHC.

На рисунке 1 схематично представлены различные этапы нашего подхода, которые подробно описаны в следующих подразделах. Подробная информация о программных пакетах и используемом оборудовании предоставляется в качестве дополнительной информации.

Рисунок 1: Обзор нашей методологии: она основана на обработке виртуальных слайдов TMA для оценки необходимости и эффективности методов нормализации изображений IHC (подробности см. В основном тексте).

SDA: окрашивающая темнота (см. Раздел «Выделение и сопоставление цветовых векторов»).QC: этап контроля качества (см. Раздел «Необходимость и эффективность этапов нормализации изображения»).

Выборка эталонного изображения

Мы используем метод, который мы ранее разработали для обработки полных изображений слайдов ТМА, чтобы правильно идентифицировать многочисленные круглые образцы тканей (ядра диаметром 600 мкм), присутствующие на слайде ¹⁹. Чтобы упростить и ускорить настройку процесса нормализации, мы создаем мозаичное изображение из каждого изображения TMA, характеризующего пакет IHC, как показано на дополнительном рис.S1e. Это делается на каждом изображении слайда TMA с полным разрешением (0,452 мкм / пиксель) путем обрезки в определенном месте каждого ядра квадратной области размером около 250 мкм (т.е. области 500 × 500 пикселей). Поскольку наши изображения слайдов TMA насчитывают около 100 ядер, каждое контрольное изображение пакета включает около 25 миллионов пикселей. Чтобы проверить надежность метода, мы генерируем различные мозаичные эталонные изображения для каждой партии IHC для каждого анализируемого маркера путем систематической обрезки различных местоположений ядра. Впоследствии мы исследуем возможность уменьшения количества ядер TMA.

Экстракция и сопоставление цветовых векторов

Этот шаг направлен на извлечение цветовых векторов, представляющих пятна, обычно используемые при ИГХ, то есть коричневый для окрашенной DAB ткани, свидетельствующей об экспрессии белка, и синий для контрастного окрашивания ткани HEM. В методах нормализации, приведенных в таблице 1, выделение цветового вектора основано на деконволюции, после чего интенсивность каждого (RGB) канала преобразуется в OD (см. Уравнение (1)). Как упоминалось в уровне техники, OD-подобное преобразование интенсивности окрашивания имеет различные преимущества, даже если закон Бера-Ламберта не применяется.Чтобы избежать неправильного толкования, мы ввели термин «окрашивающая темнота» ( SDA ) для этого количества.

Преобразование затемнения

Мы вычисляем SDA , используя уравнение (2).

, где I _c ( p ) — интенсивность изображения пикселя p в линейном канале RGB c и I _{0, c} — интенсивность фона в том же канал. В настоящем исследовании мы улучшаем способ вычисления I ₀ путем явного количественного определения интенсивности фона стеклянного предметного стекла.С этой целью мы преобразуем мозаичное изображение в изображение в оттенках серого, выбирая для каждого пикселя минимальное значение I _c ( p ) среди каналов RGB. Мы применяем пороговое значение Оцу к этому изображению в оттенках серого, чтобы обнаружить ткань, и применяем морфологическое расширение, чтобы сформировать тканевую маску. Чтобы избежать выбросов, которые могут быть вызваны стеклянными артефактами, мы установили I _{0, c} в режим распределения интенсивности в каждом канале вне этой маски.Мы вводим функцию Min в уравнение (2), чтобы избежать любого отрицательного значения (из-за очень светлых пикселей, для которых I _c ( p )> I _{0, c}) . Мы применяем это преобразование SDA перед извлечением цветовых векторов независимо от используемого метода, в отличие от того, что мы сделали в нашем предварительном исследовании ¹⁸, где использовались и демонстрировались различные преобразования OD, упомянутые в таблице 1 для ссылок 8 и 11. некоторые недостатки.

Слепая деконволюция цвета

Мы тестируем пять различных методов для извлечения цветовых векторов в трехмерном (3D) пространстве SDA . Все они основаны на факторизации матрицы данных SDA , X (3 × n ), как в уравнении (3). Однако они существенно различаются по своему выбору целевой функции и / или ограничений, как показано ниже:

, где M (3 × 3) — это матрица цветной деконволюции, а C (3 × n ) — деконволюционный коэффициент. матрица.

В контексте стандартных изображений IHC M определяется на основе цветовых векторов, определяющих синюю (HEM) и коричневую (DAB) оси, как показано в уравнении (4).

, где a и b — нормализованные векторы, определяющие синюю (HEM) и коричневую (DAB) оси, тогда как c — их перекрестное произведение. Фактически, этот вектор 3 ^rd не является абсолютно необходимым, но может использоваться в качестве контроля качества (для которого ожидаются очень маленькие значения) для плоскости HEM-DAB.Кроме того, визуализация облаков пикселей в 2D деконволюционном пространстве легко выявляет дефекты метода деконволюции, как показано в результатах (см. Раздел «Извлечение цветового вектора»).

Метод 1 , с пометкой « Macenko », был адаптирован из исх. 8. Этот метод основан на том факте, что изображения IHC являются двухцветными, а распределение цвета пикселей в пространстве SDA должно в основном располагаться в плоскости, которую можно идентифицировать с помощью PCA. Эту гипотезу легко проверить, вычислив процент объясненной дисперсии, который во всех наших экспериментах приближается к 100%.Однако ортогональное ограничение делает главные компоненты (ПК) неподходящими для описания цветов пикселей, как показано на рисунках 2а и 3а, где два ПК были переведены в исходную точку, чтобы сохранить исходную точку системы SDA. Таким образом, новые оси должны быть определены на главной плоскости, чтобы лучше соответствовать цветовому конусу. Как подробно описано в дополнительной информации, новые синие и коричневые оси определены на основе угла между каждым пикселем и 1-м главным компонентом, осью x на рисунках 2a и 3a.Для вычисления матрицы деконволюции ( M в уравнении (3)) эти два цветовых вектора нормализуются с вектором 3 ^rd в качестве их перекрестного произведения.

Рисунок 2 Эксперимент

ERG: пиксельные облака на плоскости HEM (X) — DAB (Y), определенные с помощью ( a ) PCA, ( b ) «Li-init», ( c ) « Li-init-NMF », ( d )« Macenko », ( e )« SNMF »(со стандартной инициализацией), ( f )« Li-init-SNMF ». Диаграммы рассеяния показывают только 2500 цветных пикселей, регулярно отбираемых из эталонных изображений.

Рисунок 3 Эксперимент

IGF2R: пиксельные облака на плоскости HEM (X) — DAB (Y), определенные с помощью ( a ) PCA, ( b ) «Li-init», ( c ) « Li-init-NMF », ( d )« Macenko », ( e )« SNMF »(со стандартной инициализацией), ( f )« Li-init-SNMF ». Диаграммы рассеивания показывают всего 2500 пикселей.

Методы 2 и 3 , , обозначенные соответственно « Li — init » и « Li — init — NMF », адаптированы из исх.11. Мы отдельно рассматриваем два шага метода деконволюции, предложенного в [5]. 11 для расширения, описанного в методе 5. Подход NMF направлен на то, чтобы избежать отрицательных значений в конечной деконволюционной плоскости, как показано на рисунках 2b, c и 3b, c. Однако NMF подлежит локальной минимизации, которая зависит от инициализации и, следовательно, требует хорошего приближения цветовых векторов для инициализации процесса факторизации. Этап инициализации (обозначенный как «Li-init») включает в себя этап кластеризации в цветовом пространстве HSV для извлечения двух исходных цветовых векторов, которые преобразуются обратно в RGB, а затем в SDA в контексте IHC.Затем для извлечения окончательных векторов используется алгоритм NMF. Мы называем этот полный процесс «Li-init-NMF» (подробности см. В дополнительной информации).

Методы 4 и 5 , соответственно обозначены « SNMF » и « Li — init — SNMF ». Сюй и др. . ¹⁶ предлагают использовать SNMF вместо NMF для извлечения цветовых векторов. SNMF отличается от NMF своей целевой функцией, в которой вводятся термины регуляризации и разреженности (см. Дополнительную информацию), чтобы помочь обойти проблемы, которые могут быть обнаружены с помощью NMF.Однако авторы не предоставляют информации об инициализации, которую они используют для алгоритма SNMF. В нашем эксперименте мы тестируем этот метод со стандартной инициализацией, описанной в ссылке. 20 или предложено в исх. 11. Эти два варианта обозначены соответственно «SNMF» и «Li-init-SNMF».

Из-за времени, необходимого для обработки методов факторизации на основе NMF и SNMF, следует отметить, что мы используем только 0,1% пикселей, регулярно отбираемых из нашего эталонного изображения, то есть около 25000 пикселей на TMA, для извлечения цветовых векторов. представитель партии IHC.Что касается этой выборки, также была проанализирована надежность извлеченных таким образом цветовых векторов (см. Раздел «Извлечение цветовых векторов»).

Межпакетное согласование цветов

После получения матрицы деконволюции M уравнения (3) одним из вышеуказанных методов мы можем разложить изображение SDA на их компоненты пятен (DAB и HEM в нашем контексте IHC). В нашей методологии матрица M независимо вычисляется для каждого мозаичного изображения, преобразованного в SDA, которое мы используем в качестве эталона пакета IHC.Таким образом, для пакета k мозаичное изображение, преобразованное SDA, можно деконволютировать, применяя уравнение (5) с его собственной матрицей деконволюции цвета ( M _k).

После применения деконволюции к каждому мозаичному изображению извлеченные цветовые векторы определяют цветовое пространство (HEM-DAB), специфичное для каждого пакета IHC. Если деконволюция является подходящей и эффективной, векторы пикселей, SDA _{dec, k}, должны находиться в одинаково выровненных цветовых пространствах и, таким образом, обеспечивать сопоставимые распределения значений для последующей обработки изображения.

Подгонка распределения SDA

Этот шаг выполняется для каждого деконволюционного канала (HEM или DAB) и направлен на точное соответствие распределений значений SDA _dec, извлеченных из мозаичных изображений, представляющих различные пакеты IHC. Партия, обозначенная t , выбирается в качестве цели, к которой будут приспособлены каждая другая партия, обозначенная k . Этот дополнительный шаг не всегда рассматривается в различных методах, встречающихся в литературе.Мы тестируем четыре метода подгонки, включая два метода, предложенных в литературе ^8,15, и два обобщения, которые мы вводим, то есть методы линейной и B-сплайновой регрессии (подробности см. В дополнительной информации).

Каждый метод подгонки определяет преобразование для соответствия распределению SDA _{dec, k, c} с целевым ( SDA _{dec, t, c}). Результат помечен как Fit _t ( SDA _{dec, k, c}) и соответствующий вектор, Fit _t ( SDA _{dec, k}), выражает нормализованные значения SDA пикселя в деконволютивном пространстве.

Необходимость и эффективность этапов нормализации изображения

Напоминаем, что в предлагаемой методике к каждому пакету IHC добавляется срез из одного и того же блока TMA. В контексте нашей контролируемой платформы (см. Раздел «Экспериментальный план для количественной оценки»), мы можем предположить, что для этих срезов распределения значений SDA _dec должны быть одинаковыми при отсутствии вариаций между партиями. . Соответственно, чтобы оценить качество и фактический вклад различных шагов нормализации, мы оцениваем сходство между распределениями значений SDA _{dec, t, c} и SDA _{dec, k, c}. в трех следующих ситуациях: (i) перед подбором цветов, т.е.е. путем наложения цветовых векторов, извлеченных из партии t , в каждую партию k , (ii) после согласования цветов между партиями и (iii) после дополнительного этапа аппроксимации распределения SDA (см. этапы контроля качества на рис. 1). В каждой ситуации сравниваемые нами распределения устанавливаются из выборок пикселей, отличных от мозаичных изображений, которые используются как для извлечения цветового вектора, так и для установки дополнительного преобразования SDA для улучшения подгонки распределения. Сходство распределения затем проверяется с помощью графиков Q – Q, установленных для 1000 квантилей каждого распределения.Эти графики должны соответствовать 45-градусной опорной линии ( y = x ) в случае равенства распределения. Мы оцениваем это свойство подгонки с точки зрения среднеквадратичной ошибки (RMSE). Мы также используем двухвыборочную статистику Колмогорова-Смирнова (KS), которая вычисляет максимальную разницу между эмпирическими кумулятивными функциями распределения двух выборок. На практике следует применять только те шаги, которые действительно способствуют схожести пакетного распределения.

Нормализация изображения

Перед количественной оценкой окрашивания (см. Раздел «Экспериментальный план для количественной оценки») мы применяем процесс нормализации между партиями к полным изображениям ТМА следующим образом:

1
Преобразование каждого изображения в темноту пятна с помощью уравнения ( 2).
2
Применение деконволюции с использованием векторов, извлеченных из мозаичного эталонного изображения с использованием уравнения (5).
3
Необязательно: применение шага подгонки SDA в соответствии с целью к каждому пикселю изображения.

В то время как первые два шага составляют внутрипакетный процесс, генерирующий нормализованное (и, следовательно, сопоставимое) цветовое пространство, третий шаг выполняет межпакетную обработку, чтобы обеспечить отображение распределения одноканальных значений. Этот третий шаг требует выбора одной партии (например,грамм. первый) в качестве цели, к которой должны быть настроены все остальные. Как только это будет сделано, количественное определение окрашивания может быть выполнено в деконволютированном пространстве. Для целей визуализации, позволяя, среди прочего, качественную оценку и / или подсчет биомаркеров патологами, можно вернуться к нормализованному изображению RGB с помощью уравнений (6) и (7), которые соответственно вычисляют нормализованный ( N ) вектор SDA. и нормализованные значения интенсивности в пространстве RGB, используя уравнение (2), для изображений пакета k , принимая пакет t в качестве цели.

Методы иммунофлуоресцентного окрашивания

Дом
Методы иммунофлуоресцентного окрашивания

Методы иммунофлуоресцентного окрашивания также можно успешно использовать для мечения нескольких антигенов в одном препарате. Эти методы особенно полезны для совместной локализации антигенов в одном отделе клетки и в этом отношении имеют явное преимущество перед системами обнаружения на основе ферментов.

Традиционно двойное флуоресцентное мечение достигается с помощью флуоресцентно конъюгированных вторичных антител против первичных антител разных видов. Хотя этот метод в целом имеет тенденцию быть менее чувствительным, чем ферментативное окрашивание, чувствительность флуоресцентного красителя можно повысить, используя (стрепт) систему авидин-биотин для амплификации метки. Многие принципы, касающиеся мечения множественных антигенов, применимы как к иммунофлуоресцентным, так и к ферментативным методам (см. Раздел «Иммуноферментные методы окрашивания»).Для достижения наилучших результатов рекомендуется последовательное окрашивание каждого первичного антитела. Как и в случае применения ферментов, порядок маркировки, соответствующие контроли и дополнительные этапы блокирования могут быть важны для получения оптимальных результатов. В отличие от ферментативного окрашивания, особое внимание следует уделять виду используемых первичных антител. Для флуоресцентных применений два первичных антитела обычно должны быть от разных видов, в противном случае может возникнуть артефактное совместное окрашивание антигенов.Однако использование двух первичных антител мыши является исключением. См. Раздел «Множественное иммунофлуоресцентное маркирование с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител».

Кроме того, если система (стрепт) авидин-биотин используется для визуализации обоих антигенов, ДОЛЖЕН использоваться блок (стрепт) авидин-биотин перед вторым этапом первичного антитела.

После маркировки важно сохранить интенсивность флуоресцентного сигнала, поскольку некоторые флуоресцентные продукты склонны к быстрому выцветанию при просмотре под микроскопом.В большинстве случаев это легко достигается путем нанесения на препарат покровного стекла, предотвращающего выцветание и фотообесцвечивания, такого как монтажная среда VECTASHIELD®. Использование VECTASHIELD® также позволяет хранить препарат в течение длительного времени без значительной потери интенсивности.

Автофлуоресценция ткани может скрывать окрашивание в зависимости от типа ткани, метода фиксации и фильтра микроскопа, используемого для визуализации. Это следует оценить перед окрашиванием и, при необходимости, подавить автофлуоресценцию, используя соответствующие методы.

Следующие протоколы предназначены для замороженных срезов тканей. Эти протоколы могут быть адаптированы для других препаратов ткани.

Толстая кишка (замороженная) — двойная этикетка
• Мульти-цитокератин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый). TM®
• Desmin (m), M.O.M. Базовый комплект, Texas Red Avidin DCS (красный).

Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
• Ki67 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
• Пан-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

Тонкий кишечник (замороженный) — двойная этикетка
• PGP9.5 (м), базовый набор M.O.M.TM, стандартный набор VECTASTAIN® ABC-AP, подложка Vector® Red AP (красная).
• Desmin (m), набор M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).

Протокол: двойное иммунофлуоресцентное маркирование с использованием двух первичных антител от разных видов

Окрашивание на первый антиген

Подготовка тканей. Зафиксируйте срезы подходящим фиксатором для исследуемого антигена (см. Примечание 1).
Воздушно-сухие секции.
Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере (PBS).
Этап блокировки авидина / биотина. При необходимости выполните блокировку авидина / биотина (набор для блокирования авидина / биотина, № по каталогу SP-2001). Инкубируйте секции с раствором авидина в течение 15 минут. Кратко промойте буфером, затем инкубируйте в растворе биотина в течение 15 минут. Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере. Этот этап блокировки можно исключить, если соответствующие средства управления определили, что этот этап не нужен.
Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы в течение 20 минут с буфером, содержащим 5% нормальную блокирующую сыворотку (NS), которая была приготовлена из видов, у которых получены вторичные антитела.
Удалите лишнюю сыворотку из срезов.
Первичное антитело. Инкубируйте срезы с первым первичным антителом, разведенным в соответствующем разбавителе антител (буфер, содержащий 5% NS), используя подходящую концентрацию и продолжительность инкубации.
Промыть 5 минут в буфере.
Вторичное антитело. Инкубируйте срезы в течение 30 минут с биотинилированным вторичным антителом (5-10 мкг / мл, разведенным в буфере, содержащем 5% NS).
Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
Конъюгат авидина. Инкубируйте срезы с флуоресцеином авидином DCS (15-20 мкг / мл, разведенным в буфере) в течение 5-10 минут.
Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
Окрашивание на второй антиген
Этап блокировки авидина / биотина. Примените блок авидина / биотина в соответствии с этапом 4. (Этот этап необходимо выполнить, чтобы предотвратить взаимодействие второго набора реагентов для маркировки с первым набором реагентов для маркировки).
Этап блокировки белка. Инкубируйте секции в течение 20 минут с 5% NS.
Удалите лишнюю сыворотку из срезов.
Первичное антитело. Инкубируйте срезы со вторым первичным антителом, разведенным в соответствующем разбавителе антител (буфер, содержащий 5% NS), используя подходящую концентрацию и продолжительность инкубации.
Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
Вторичное антитело. Инкубируйте срезы в течение 30 минут с биотинилированным вторичным антителом (5-10 мкг / мл, разведенным в буфере, содержащем 5% NS).
Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
Авидин конъюгат. Инкубируйте срезы с Texas Red® Avidin DCS (15-20 мкг / мл, разведенный в буфере) в течение 5-10 минут.
Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
Установите с помощью подходящего монтажного материала VECTASHIELD®.
Наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

ПРИМЕЧАНИЯ:
1. Ткани, фиксированные альдегидом (например, формалин), имеют тенденцию быть автофлуоресцентными и могут затруднять интерпретацию специфического сигнала флуоресцеина.

Множественное иммунофлуоресцентное мечение с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител

Специфическая локализация мышиного первичного антитела на ткани мыши была проблематичной до внедрения нашего набора для иммунодетекции Vector® Mouse on Mouse (M.O.M.TM).

Эти наборы M.O.M.TM блокируют эндогенные иммуноглобулины мыши в ткани мыши, обеспечивая точное распознавание первичного антитела мыши биотинилированным вторичным антителом против IgG мыши, устраняя запутанный фон.

Используя ту же технологию блокирования мышиного Ig, можно флуоресцентно детектировать несколько первичных антител мыши на одном и том же срезе ткани, независимо от того, имеет ли ткань мышиное происхождение.

Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
• Ki67 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
• CD20 (m), базовый комплект M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

№ M.O.MTM. Набор: Кишечник мыши (замороженный) — двойная этикетка
• Периферин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, флуоресцеин авидин DCS (зеленый).
• Десмин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, Texas Red® Avidin DCS (красный).
ПРИМЕЧАНИЕ СМЕШИВАНИЕ ФОНА И СИГНАЛОВ.

С набором M.O.M.TM: кишечник мыши (замороженный) — двойная этикетка
• Периферин (m), набор M.O.M.TM флуоресцеина (зеленый).
• Desmin (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный). СРАВНИТЬ С ФОТОГРАФИЕЙ НАБОР НОМЕРА NO M.O.M.TM.

Набор M.O.M.TM: толстая кишка (замороженный) — двойная этикетка
• Мультицитокератин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, флуоресцеин авидин DCS (зеленый).
• Десмин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, Texas Red® Avidin DCS (красный).
ПРИМЕЧАНИЕ СМЕШИВАНИЕ ФОНА И СИГНАЛОВ.

С набором M.O.M.TM: толстая кишка (замороженная) — двойная этикетка
• Мультицитокератин (m), набор M.O.M.TM флуоресцеина (зеленый).
• Desmin (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный). СРАВНИТЬ С ФОТО

НАБОРА ADJACENT NO M.O.M.TM

Протокол: множественное иммунофлуоресцентное мечение с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител

Окрашивание на первый антиген

Подготовка ткани.Зафиксируйте срезы подходящим фиксатором для исследуемого антигена (см. Примечание 1).
Воздушно-сухие секции.
Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере (PBS).
Этап блокировки авидина / биотина. Выполнить

Блокирование авидина / биотина, если необходимо (набор для блокирования авидина / биотина, № по каталогу SP-2001). Инкубируйте секции с раствором авидина в течение 15 минут. Кратко промойте буфером, затем инкубируйте в растворе биотина в течение 15 минут.Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере. Этот этап блокировки можно исключить, если соответствующие средства управления определили, что этот этап не нужен.

Этап блокировки мышиного Ig. Инкубируйте срезы в течение 1 часа в рабочем растворе реагента для блокировки мышиного иммуноглобулина M.O.M.TM (см. Примечание 2).
Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере (см. Примечание 2).
Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы тканей в течение 5 минут в рабочем растворе разбавителя M.O.M.TM.
Первичное антитело.Удалите из срезов избыток разбавителя M.O.M.TM. Разведите первичное антитело в разбавителе M.O.M.TM до подходящей концентрации. Инкубируйте срез в разбавленном первичном антителе в течение 30 минут (см. Примечание 3).
. Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере.
Вторичное антитело. Нанесите рабочий раствор биотинилированного реагента против мышиного IgG M.O.M. Инкубируйте срезы в течение 10 минут.
Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере.
Авидин конъюгат.Нанесите флуоресцеин авидин DCS, приготовленный в соответствии с инструкциями к набору M.O.M.TM. Инкубируйте секции в течение 5 минут (см. Примечание 4).
Промойте срезы 2 раза по 5 минут в буфере.
Окрашивание на второй антиген
Этап блокировки авидина / биотина. Выполните блокировку авидина / биотина в соответствии с этапом 4. (Этот этап необходимо выполнить, чтобы предотвратить взаимодействие второго набора реагентов для маркировки с первым набором реагентов для маркировки).
Этап блокировки мышиного Ig.Инкубируйте срезы в течение 1 часа в рабочем растворе блокирующего реагента M.O.M.TM Mouse Ig Blocking Reagent.
Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере.
Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы в течение 5 минут в рабочем растворе разбавителя M.O.M.TM.
Первичное антитело. Удалите из срезов избыток разбавителя M.O.M.TM. Разведите второе первичное антитело в разбавителе M.O.M.TM до подходящей концентрации. Инкубируйте секцию в течение 30 минут (см. Примечание 3).
Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере.
Вторичное антитело. Нанесите рабочий раствор биотинилированного реагента против мышиного IgG M.O.M. Инкубируйте срезы в течение 10 минут.
Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере.
Авидин конъюгат. Нанесите Texas Red ® Avidin DCS в концентрации 15-20 мкг / мл в буфере. Инкубируйте секции в течение 5-10 минут (см. Примечание 4).
Промойте срезы 2 раза по 5 минут в буфере.
Установите соответствующий монтажный материал VECTASHIELD®.

ПРИМЕЧАНИЯ:

1. Ткани, фиксированные альдегидом (например, формалин), имеют тенденцию быть автофлуоресцентными и могут затруднять интерпретацию специфического сигнала флуоресцеина.

2. Для немышиной ткани шаг 5 и шаг 6 пропустить.

3. Оптимальные результаты с набором M.O.M.TM обычно достигаются при инкубации первичных антител в течение 30 минут. Концентрации первичных антител должны быть оптимизированы для множественных применений маркировки.

4. Определить оптимальный порядок флуоресцентной метки.Другие реагенты, конъюгированные с флуорохромом, стрептавидином или авидином, можно заменить, как только будет установлен оптимальный сигнал / шум.

5. Руководство по поиску и устранению неисправностей M.O.M. доступно в Интернете или по запросу.

Скелетная мышца (замороженная, нефиксированная) — двойная этикетка
• Альфа-саркогликан (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
• Мышечный актин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

Двоеточие (замороженное) — Двойная этикетка
• Desmin (m), M.O.Набор M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
• Периферин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

Простата (замороженная) — двойная этикетка
• Мышечный актин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
• Мульти-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

Карцинома молочной железы (замороженная) — двойная этикетка
• Рецептор эстрогена (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
• Мультицитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, стандартный набор VECTASTAIN® ABC-AP, субстрат Vector® Red AP (красный).

Миндалины (замороженные) — Двойная этикетка
• Ki67 (m), M.O.M.TM Basic Kit, Texas Red® Avidin DCS (красный). • CD20 (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
• Ki67 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
• CD20 (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS. Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
• p63 (m), набор M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
• Мульти-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).
Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
• p63 (м), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).
• Мультицитокератин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый). Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

Принципы, наборы и протоколы окрашивания DAB

Общие сведения о применении окрашивания DAB, альтернативах, преимуществах и недостатках.Ознакомьтесь с наборами и протоколами для окрашивания DAB.

Для получения простых результатов при окрашивании DAB используйте простой набор субстратов DAB или полный набор для окрашивания DAB, например наборы стрептавидин-биотин HRP / DAB и наборы HRP / DAB для полимерного метода. В качестве альтернативы вы можете собрать реагенты для окрашивания DAB самостоятельно, используя вторичные антитела, конъюгированные с биотином, вторичные антитела, конъюгированные с HRP-полимером, и конъюгаты стрептавидин-HRP.

Принципы и применение окрашивания DAB

DAB (3,3′-диаминобензидин) является производным бензола.Чаще всего он используется при иммуногистохимическом (ИГХ) окрашивании в качестве хромогена. Он также используется при гибридизации in situ (ISH) и иногда в дот-блоттинге и вестерн-блоттинге.

При окрашивании DAB, DAB окисляется перекисью водорода в реакции, обычно катализируемой пероксидазой хрена (HRP). Окисленный DAB образует коричневый осадок в месте расположения HRP, который можно визуализировать с помощью световой микроскопии.

Осадок DAB нерастворим в воде, спирте и других органических растворителях, наиболее часто используемых в лаборатории (таких как ксилол и изопропанол).Это обеспечивает большую гибкость при последующей обработке среза ткани, например, при выборе контрастного окрашивания и среды для закрепления. Окрашивание DAB также является термостойким, поэтому его можно использовать в экспериментах с двойной меткой IHC / ISH, и оно чрезвычайно стабильно — фактически окрашенные слайды часто стабильны в течение многих лет.

При использовании вместе с раствором никеля или кобальта в качестве усилителя DAB окрашивание DAB приобретает более интенсивный черный цвет.

Связывание HRP и первичных антител для окрашивания DAB

При ИГХ существует три основных метода связывания HRP с первичным антителом, используемым для окрашивания.Они имеют следующие преимущества и недостатки:

— Первичные антитела, непосредственно конъюгированные с HRP
Меньше амплификации и, следовательно, менее чувствительны, чем следующие методы. Очень простой протокол. Требование конъюгации первичного антитела с HRP.

— Биотинилированные вторичные антитела в сочетании со стрептавидин-HRP в методе ABC (Avidin Biotin Complex)
Требование блокирования эндогенного биотина во избежание фонового окрашивания. Наиболее широко используемый метод в исследовательских лабораториях.

— Вторичные антитела к HRP-полимеру
Более короткий протокол, чем метод ABC. Высокая чувствительность при низком фоне. Abcam использует этот метод для проверки антител в ИГХ.

Jovicic N et al. Использовали набор для метода ab64259 HRP / DAB стрептавидин-биотин ABC для окрашивания CD68 в залитых парафином срезах печени мыши. Окрашивание коричневым DAB показывает присутствие CD68.

Альтернативы окрашиванию DAB

По сравнению с флуоресцентными методами, используемыми для IHC, хромогенное обнаружение, такое как окрашивание DAB, обычно более чувствительно из-за ферментативной амплификации, используемой с окрашиванием DAB и аналогичными методами.Однако невозможно разрешить субклеточные структуры с помощью окрашивания DAB в той же степени, что и с помощью флуоресцентной микроскопии.

Хотя DAB в подавляющем большинстве является самым популярным хромогеном, существуют альтернативы. См. Наше руководство по хромогенам и энхансерам для получения полной информации о различных хромогенах, их преимуществах и недостатках.

Ловушки, которых следует избегать при окрашивании DAB

Недостатком DAB является то, что он медленно реагирует с перекисью водорода даже в отсутствие фермента пероксидазы.Это означает, что после объединения DAB с перекисью водорода его следует использовать относительно быстро, чтобы избежать образования коричневого осадка в растворе, который будет способствовать фоновому окрашиванию. Обычно наборы для окрашивания DAB поставляются с концентрированным субстратом DAB и отдельным буфером, содержащим перекись водорода, которые необходимо объединить незадолго до использования.

Имейте в виду, что DAB токсичен — это предположительно тератоген и канцероген, поэтому с ним следует обращаться в соответствии с надлежащей лабораторной практикой.

Протоколы окрашивания DAB

Полные протоколы иммуноокрашивания с использованием DAB см. В нашей коллекции утвержденных протоколов ИГХ, основанных на нашем собственном опыте проверки антител.

Во многих случаях при окрашивании DAB используются предварительно приготовленные растворы DAB, например, в наборе субстратов DAB ab64238. Также можно приготовить DAB с помощью таблеток DAB. Обычно используются таблетки, а не порошок DAB, чтобы свести к минимуму риски для здоровья и безопасности при приготовлении раствора DAB.

Независимо от того, используете ли вы таблетки или заранее приготовленные растворы, прочтите инструкции производителя по приготовлению, поскольку они могут варьироваться, например, если перекись водорода уже включена или должна быть добавлена.

После приготовления раствора DAB с включенной перекисью водорода и после окрашивания срезов HRP их просто нужно инкубировать с раствором DAB в течение нескольких минут с последующей промывкой в любом буфере, таком как PBS, или в воде. Окрашивание DAB обычно сопровождается контрастным окрашиванием, дегидратацией в серии этанола и монтированием.

Чтобы избежать чрезмерного окрашивания DAB, лучше всего наблюдать за процессом окрашивания под микроскопом и удалять DAB при появлении светло-коричневого окрашивания.

Ссылка

Jovicic N et al. PLoS ONE 10: e0134089 (2015)

Введение в окрашивание H&E: протокол, передовой опыт, шаги и многое другое: Leica Biosystems

Для рутинной диагностики использование гематоксилина и эозина (H&E) намного предпочтительнее для просмотра деталей клеточной и тканевой структуры патологами. Изменение интенсивности пятен часто определяется опытом патологоанатома и личными предпочтениями. Поскольку это окрашивание демонстрирует такой широкий спектр функций цитоплазматического, ядерного и внеклеточного матрикса, почти во всех учебных текстах используются изображения H&E.Сегодня мы продолжаем использовать это простое и незаменимое краситель, которое оставалось неизменным уже более века.

Получайте обновления Knowledge Pathway прямо на ваш почтовый ящик.

Если вы просмотрели этот образовательный веб-семинар, тренинг или учебное пособие по программе Knowledge Pathway и хотели бы подать заявку на получение кредитов для продолжения образования в вашей сертифицирующей организации, загрузите форму, чтобы помочь вам добавить образовательные кредиты, о которых вы сообщаете, в свой транскрипт.

Подать заявку на самооценку образовательных кредитов

Рис. 1: Skin H&E.Обратите внимание на сбалансированную окраску этого участка кожи. Ядра окрашены в фиолетовый цвет, а компоненты цитоплазмы — в розовый.

Процедура окрашивания H&E следует базовому протоколу:

Депарафинизация
Обезвоживание
Гематоксилин
Дифференциация
Синение
Эозин
Обезвоживание
Очистка
Покровное стекло

Формат легко воспроизводится и воспроизводится реагенты достаточно эластичны, чтобы обеспечить постоянное окрашивание большого количества слайдов перед заменой реагентов.

Рис. 2: Двоеточие H&E. Обратите внимание на сбалансированную окраску в этой части толстой кишки. Микроворсинки на столбчатом эпителии очень четкие.
Фотография предоставлена: Стэнли Хансен

В прошлом пятна и их компоненты обычно изготавливались в лаборатории. Готовые реагенты, имеющиеся в продаже, были необычными и дорогими. Таким образом, в качестве экономичного способа выполнения H&E специалисты научились делать красители по мере необходимости.Задача заключалась в том, чтобы убедиться, что качество пятна остается неизменным. Разные специалисты следуют рецептам, используя свой индивидуальный подход, поэтому изготовление красителей обычно оставалось одним человеком. Тем не менее, в лаборатории было больше технических специалистов, поэтому время, необходимое для подготовки реагентов, не уменьшало общую рабочую нагрузку команды.

Рис. 3: Плацента H&E. Красные кровяные тельца в этом срезе плаценты представляют собой яркую окраску, которую можно испытать с помощью этого простого красителя.

Многие лаборатории считают заказ своих красителей самым простым способом обеспечить стабильное и воспроизводимое качество. Большое разнообразие комбинаций красителей гематоксилином и эозином дает возможность настроить желаемые результаты с очень небольшими хлопотами. По мере того, как все больше технических специалистов выходят на пенсию и компании становятся более экономичными, сокращение штата делает использование коммерчески доступных реагентов идеальным, потому что технические специалисты могут лучше сосредоточиться на внедрении и нарезке, которые являются областями лаборатории, которые предлагают наименьшую степень автоматизации.

Рис. 4. Клубочки (красная стрелка) и канальцы (синяя стрелка), отображаемые с помощью H&E. Ядра окрашены в фиолетовый цвет, а компоненты цитоплазмы — в розовый.

Для новых профессионалов в области гистологии времена создания реагентов быстро уходят в прошлое. Я считаю, что этот сдвиг может быть проблематичным, прежде всего потому, что часть искусства, характерного для гистологии, утеряна. Одна из моих личных проблем при работе со студентами — помочь им устранить аномалии окрашивания.Когда пятна производятся в лаборатории, команда на собственном опыте узнает, что происходит, когда компонент отсутствует или неправильно добавлен в смесь. Эти изменения могут привести к незначительным изменениям окрашенных слайдов, которые, как ожидается, в конечном итоге исправит команда гистологов. В конечном счете, новые группы гистологов могут столкнуться с трудностями при устранении незначительных изменений, которые можно легко исправить, не имея опыта создания реагентов и уроков, извлеченных в этом процессе.

Что в пятне H&E?

Окрашивание гематоксилином и эозином используется во многих областях гистологической лаборатории, включая замороженные срезы, тонкоигольные аспираты и залитые парафином ткани.Чтобы лучше понять, что делает слайд хорошо окрашенным, важно понимать компоненты пятна.

Гематоксилин используется для иллюстрации ядерных элементов в клетках. Глубина окраски зависит не только от количества ДНК в ядрах, но и от продолжительности времени, в течение которого образец находится в гематоксилине.

Гематоксилин — довольно простой в изготовлении краситель. Сам краситель добывается из дерева Haematoxylum campechianum. Окисление гематоксилина производит гематеин, который на самом деле является красителем, используемым для окрашивания H&E.Добавление протравы улучшает способность гематеина прикрепляться к анионным (отрицательно заряженным) компонентам тканей.

Рис. 5: На этом изображении крупноклеточной анапластической медубластомы гематоксилин играет ключевую роль в диагностике. Обратите внимание на митотические цифры, указывающие на быстрорастущую опухоль. В клетках также отмечается нерегулярность ядра и слипание хроматина. Фото: Frontalcortex.com

Гематоксилины обычно классифицируются по протраве, используемой перед окрашиванием.Протравы усиливают положительный ионный заряд гематина. Это способствует связыванию гематина с анионным тканевым компонентом, которым чаще всего является хроматин. Тип протравы также влияет на окончательный цвет окрашенных компонентов. Наиболее распространенной протравой, используемой в рутинной гистологии, является сульфат алюминия-аммония (квасцы). Эта протрава заставляет ядра окрашиваться в красный цвет, который затем меняется на более знакомый синий цвет, когда образец позже промывают слабощелочным раствором.

Гематоксилин Майера — это гематоксилин квасцов, широко используемый краситель, который можно использовать как для прогрессирующего, так и для регрессивного окрашивания.Его часто используют как ядерный контраст для специальных красителей и иммуногистохимии. Для этих целей Майер используется для окрашивания ядер, а затем их воронения без использования дифференциатора. Майер — краситель на водной основе.

Гематоксилин Харриса — еще один широко используемый гематоксилин квасцов, который можно использовать для прогрессивного окрашивания цитологических образцов, но также можно использовать для прогрессивного или регрессивного окрашивания в гистологии. Окрашивание дает четкие детали ядра.Одна из проблем при использовании Харриса заключается в том, что его лучше всего дифференцировать с мягкой кислотой, в отличие от более часто используемых дифференциаторов на основе соляной кислоты. Харрис — это пятно на спиртовой основе. Гематоксилин Гилла представляет собой гематоксилин квасцов. Его можно использовать как прогрессивное или регрессивное окрашивание, и он доступен в различных концентрациях. Поскольку в его состав входят вода и этиленгликоль, самоокисление пятна обычно предотвращается в течение нескольких месяцев, что делает его более стабильным, чем гематоксилин Харриса. Однако природа жабр такова, что может происходить внеядерное окрашивание.Муцин и даже клей, используемый на предметном стекле, могут сильно загрязниться жабрами.

Гематоксилины, которые используют соли железа в качестве протравы, обычно используются в специальных красителях. Это потому, что они могут демонстрировать больше тканевых структур, чем гематоксилины квасцов, такие как миелиновые и эластиновые волокна. Один из самых известных — это пятно Вейгерта, которое используется для окрашивания Верхоффа-Ван Гизона, показанного на изображении.

Рис. 6. Обратите внимание на волокна эластина в аорте, окрашенные с помощью Verhoeff-Van Gieson, также известного как эластичное окрашивание.Изменения в этих волокнах указывают на патологические процессы, которые иначе невозможно обнаружить. Фото: Стэнли Хансен

Рассмотрев ядерные пятна, давайте поговорим о красителях цитоплазматических компонентов. Эозин — наиболее часто используемый контрастный краситель, который различает цитоплазму и ядра клеток. Обычно он розовый, с разными оттенками розового для разных типов волокон соединительной ткани.

Эозин Y — это наиболее часто используемая форма эозина, которую можно использовать как в воде, так и в спирте.Добавление небольшого количества уксусной кислоты также обострит окраску эозина. Эозин с добавлением флоксина усиливает красный цвет, наблюдаемый при окрашивании H&E. Так что для тех, кто хочет видеть более насыщенные красные, можно добавить флоксин.

Рис. 7. Ядра на этом изображении имеют хороший контраст с цитоплазмой и эритроцитами (RBC) внутри кровеносного сосуда. Обратите внимание на интенсивность эритроцитов по сравнению с розовым цветом цитоплазмы окружающих клеток.

Многие лаборатории считают заказ своих красителей самым простым способом обеспечить стабильное и воспроизводимое качество.Большое разнообразие комбинаций красителей гематоксилином и эозином дает возможность настроить желаемые результаты с очень небольшими хлопотами. По мере того, как все больше технических специалистов выходят на пенсию и компании становятся более экономичными, сокращение штата делает использование коммерчески доступных реагентов идеальным, потому что технические специалисты могут лучше сосредоточиться на внедрении и нарезке, которые являются областями лаборатории, которые предлагают наименьшую степень автоматизации.

Иногда используются другие смеси эозина, такие как EA50 и EA65. Эти красители в основном используются для цитологии и, помимо эозина Y, включают светло-зеленые, желтоватые и коричневые цвета Бисмарка.Добавление этих двух красителей обеспечивает изменение цвета цитоплазмы от бледно-голубого до розового, что лучше всего проявляется в плоскоклеточных клетках мазка Папаниколау. Концентрация смеси определяет обозначение 50 или 65.

Рис. 8: На этом изображении мазка Папаниколау у пациента с плоскоклеточным раком можно оценить красоту разнообразной окраски цитоплазмы. Красная стрелка указывает на злокачественное ядро с очень маленькой цитоплазмой. Черная стрелка показывает нормализованную острую воспалительную клетку, по размеру аналогичную эритроцитам на предыдущем изображении.Обратите внимание, насколько крупнее злокачественная клетка по сравнению с нормальными ядрами на предыдущем изображении.

Дифференциация пятен дает возможность выборочно удалять пятна с тканей по вкусу зрителя. В случае гематоксилина чаще всего используются соляная кислота (для быстрой дифференциации) и уксусная кислота (для более медленной и контролируемой дифференцировки). Хотя соляная кислота (HCl) исторически была стандартом, более мягкие кислоты используются для более щадящего удаления красителя.Частично эта тенденция связана с использованием автоматического окрашивания, которое должно учитывать движение роботизированной руки в дополнение к времени, проведенному в реагенте.

Реагенты для синения, такие как «Водопроводная вода Скотта», используются для изменения цвета гематоксилина с красного на ожидаемый традиционный синий цвет. Эти слегка щелочные растворы химически изменяют краситель, вызывая это изменение цвета. В некоторых местах водопроводная вода содержит достаточно минералов, так что pH делает воду достаточно щелочной, чтобы допускать посинение ядер без необходимости использования специального реагента для посинения.Однако в большинстве случаев лаборатории обычно добавляют этот шаг, чтобы обеспечить надлежащее воронение.

В сочетании эти компоненты составляют стандартную окраску, наиболее используемую в гистологической лаборатории.

Выбор протокола окрашивания H&E

Следующим шагом к получению хорошего окрашивания является определение желаемого типа окрашивания H&E. Обычно существует три типа окрашивания H&E: прогрессивное, модифицированное прогрессивное и регрессивное.

Прогрессирующее окрашивание происходит, когда гематоксилин добавляется к ткани без последующего применения дифференциатора для удаления избытка красителя.Поскольку этап дифференциации отсутствует, может происходить фоновое окрашивание, особенно заряженных или обработанных слайдов. Патологи иногда предпочитают этот тип окрашивания, потому что неклеточный материал, такой как муцин, окрашивается гематоксилином. Это внеклеточное окрашивание может быть индикатором хорошо дифференцированных опухолей.

Рис. 9: В этом отделе толстой кишки муцин все еще виден с бокаловидными клетками.

Следующая таблица содержит протокол с простым регрессивным окрашиванием, которое обеспечивает хороший баланс ядерных и цитоплазматических пятен.Этот протокол разработан с учетом слабого кислотного дифференциатора.

После того, как компоненты окрашивания выбраны, можно приступить к базовому протоколу. Оттуда отредактируйте либо гематоксилин с шагом 30 секунд, либо эозин с шагом 15 секунд. Помните, что эозин проникает гораздо быстрее. Если нет необходимости значительно осветлить или затемнить интенсивность окрашивания эозином, лучше всего подойдут более короткие интервалы. Также важно менять только одно пятно за раз.Может показаться, что гематоксилин перекрашивается, когда эозина просто нужно богаче.

По мере того, как лаборатории продолжают расти, потребность в стабильных результатах и непрерывной пропускной способности становится очень важной. Воспроизводимость — важная часть качества лабораторных пятен. При ручном окрашивании, человеческие факторы могут привести к тому, что каждая окрашенная подставка для слайдов будет отличаться от предыдущей. Добавление автоматизации не только устраняет возможность несогласованности, но также освобождает технологов для выполнения других задач в лаборатории.

Важно, чтобы был достигнут правильный баланс красителей. Перекрашивание гематоксилином может создать иллюзию неокрашенного эозина, точно так же, как перекрашивание эозином может сделать гематоксилин светлее, чем он есть на самом деле. Поэтому при оптимизации окраски убедитесь, что вы редактируете время только одного из компонентов. Этот прием избавит вас от необходимости тратить дополнительное время на корректировку пятна.

Ксилол	2 минуты
Ксилол	2 минуты
100% этанол	2 минуты
100% этанол	2 минуты
95% этанол	2 минуты
Промывка водой	2 минуты
Гематоксилин	3 минуты
Промывка водой	1 минута
Дифференциатор (слабокислый)	1 минута
Промывка водой	1 минута
Воронение	1 минута
Промывка водой	1 минута
95% этанол	1 минута
Eosin	45 секунд
95% этанол	1 минута
100% этанол	1 минута
100% этанол	1 минута
Ксилол	2 минуты
Ксилол	2 минуты
Покровное стекло

Фиг.10: На этом изображении ядра в этом образце толстой кишки, кажется, подавляют другие клеточные компоненты. Даже красные кровяные тельца приглушены. Меньшее время в гематоксилине ИЛИ дополнительное время в эозине может обеспечить лучший баланс.

Рис. 11: Ядра в этом отделе почки теряются в розовом цвете эозина. Дополнительное время, проведенное в гематоксилине, сделало бы эти ядра более заметными.

При регрессивном и модифицированном прогрессивном окрашивании используется дифференциатор.Если дифференциатор производится собственными силами, есть вероятность, что он будет либо слишком слабым, либо слишком сильным. Оба сценария повлияют на окрашивание. Если дифференциатор сильнее, чем предполагалось, он удалит больше гематоксилина и сделает ядра бледными. Время тоже важно. Слишком много времени в правильно приготовленном дифференциаторе также приведет к удалению большего количества гематоксилина и, в конечном итоге, ослабит окраску ядер.

Умеренная кислотность имеет решающее значение для срока хранения гематоксилина. Без него щелочность ополаскивателя водопроводной водой повысит pH, так что озеро красителя может выпасть в осадок, а цвет изменится с вишнево-красного на пурпурно-красный.Периодическое добавление небольшого количества уксусной кислоты к гематоксилину поможет поддерживать соответствующий pH и может продлить срок службы пятна.

Вода используется как дифференциатор эозина. Обычно после стадии эозина используют 95% этанол. Этанол помогает ополаскивать предметное стекло, а вода вытягивает излишки эозина из тканей. Этот шаг может помочь контролировать окраску, но увеличение времени позволяет получить более светлые пятна, а сокращение времени позволяет сохранить более яркое окрашивание.Однако избыток воды в ксилоле может продолжить процесс дифференциации, и его можно увидеть после нанесения покровного стекла в виде розовой дымки на предметном стекле.

Не все ткани созданы одинаково. Кисты и образцы жировой ткани, даже при правильной обработке, могут быть очень плохо различимы после окрашивания предметного стекла. Эти образцы часто имеют открытые пространства, где жидкость или жир находились в ячейке, а тонкость клеточных стенок может создавать впечатление светлых, когда окраска является просто артефактом тканевого типа.

Высококлеточные образцы (например, миндалины, лимфатический узел) могут быть очень опасными. Помните, что у лимфоцитов мало цитоплазмы, и между клетками почти нет клеточного материала, как в других тканях. По этой причине гематоксилин не должен конкурировать с эозином. Компактная природа клеток также концентрирует ДНК, придавая этим высококлеточным тканям вид перекрашенных, хотя на самом деле их, возможно, просто нужно разрезать на более тонкие срезы.

Фиг.12: Лимфатический узел

Рис. 13: Почка — обратите внимание на различия между этим участком лимфатического узла и почки, оба сечения сечением 4 мкм. Эти образцы, окрашенные по одному и тому же протоколу, сильно различаются по внешнему виду из-за клеточности.

Использование чистых и свежих реагентов для депарафинизации необходимо для удаления парафина с предметного стекла перед добавлением красителей. В то время как ксилол является наиболее часто используемым растворителем, его заменители становятся все более популярными, поскольку они считаются менее опасными и более экологичными.Вода в растворителях, будь то из-за загрязнения реагента или из-за высокой влажности окружающей среды, снижает способность растворителя удалять парафин. Оставшийся парафин препятствует проникновению красителей в ткани, что придает им неровный вид.

Самый простой способ предотвратить это — чаще менять реагенты. Добавление небольшого количества гранул осушителя (примерно столовая ложка на емкость с реагентом) также снизит загрязнение воды растворителями. Эти меры особенно важны при использовании заменителя ксилола, поскольку эти реагенты, как правило, гораздо менее устойчивы к любому загрязнению водой, чем ксилол.

Пошаговое руководство по нанесению окрашивания H&E

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) является наиболее широко используемым красителем в лабораториях гистологии и гистопатологии. При правильном выполнении он может демонстрировать широкий спектр нормальных и аномальных клеточных и тканевых компонентов, и, тем не менее, это относительно простое окрашивание для парафиновых или замороженных срезов. В гистопатологии большая часть случаев может быть диагностирована опытным патологом с использованием только окрашивания H&E.

Небольшое количество слайдов можно эффективно окрашивать вручную, в то время как в лабораториях с высокой производительностью окрашивание можно проводить успешно и последовательно с помощью автоматических устройств для окрашивания слайдов.

Существует ряд широко используемых составов гематоксилина и эозина, каждый из которых имеет различные преимущества и недостатки. Некоторые лаборатории предпочитают готовить собственные растворы, в то время как другие выбирают готовые к использованию коммерческие продукты.

Окраска H&E дает полное представление о микроанатомии органов и тканей.Гематоксилин точно окрашивает ядерные компоненты, включая гетерохроматин и ядрышки, в то время как эозин окрашивает цитоплазматические компоненты, включая коллаген и эластические волокна, мышечные волокна и эритроциты. В высококачественном окрашивании H&E наблюдаются тонкие различия в оттенках цвета, создаваемых пятнами, особенно эозином, и это помогает в обнаружении и интерпретации морфологических изменений, связанных с заболеванием.

Важно, чтобы люди, выполняющие и оценивающие окрашивание H&E на качество, знали о тонкостях окрашивания, знали, чего можно достичь при правильном окрашивании с использованием высококачественных реагентов, и знали, что искать под микроскопом.Поддержание стабильных высококачественных окрашиваний H&E является фундаментальным требованием в лабораториях гистопатологии.

В следующих разделах описаны основные этапы окрашивания H&E.

Удалить воск

После подготовки парафиновой секции все элементы пропитываются парафиновым воском, который является гидрофобным и непроницаемым для водных реагентов, и окружается им. Большинство клеточных и тканевых компонентов не имеют естественного цвета и не видны.Первым шагом в нанесении окрашивания H&E является растворение всего парафина с помощью ксилола (углеводородного растворителя).

Гидратация секции

После тщательной депарафинизации предметное стекло пропускают через несколько смен спирта для удаления ксилола, затем тщательно промывают водой. Срез теперь гидратирован, так что водные реагенты легко проникают в клетки и тканевые элементы.

Нанесите краситель для ядер гематоксилина

Теперь предметное стекло окрашено ядерным красителем, таким как гематоксилин Харриса, который состоит из красителя (окисленный гематоксилин или гематеин) и протравы или связующего вещества (соль алюминия) в растворе.Первоначально это окрашивает ядра и некоторые другие элементы в красновато-пурпурный цвет.

Завершите «Ядерное пятно» с помощью «Посинения»

После ополаскивания в водопроводной воде срез «вороняется» обработкой слабощелочным раствором. На этом этапе гематоксилин приобретает темно-синий цвет. Теперь срез можно промыть и проверить, правильно ли окрашены ядра, показать адекватный контраст и оценить уровень фонового окрашивания.

Удалить излишки фоновых пятен (дифференцировать)

В большинстве случаев, когда используется гематоксилин Харриса, требуется этап дифференциации (обесцвечивания) для удаления неспецифического фонового окрашивания и улучшения контрастности.Используется слабокислый спирт. После такой обработки снова требуется посинение и тщательное полоскание. Методы окрашивания, включающие этап обесцвечивания или дифференциации, называются «регрессивными» окрашиваниями.

Нанесите контрастное пятно Eosin Counterstain

Срез теперь окрашивают водным или спиртовым раствором эозина (в зависимости от личных предпочтений). Это окрашивает многие неядерные элементы в разные оттенки розового.

Промыть, обезвожить, очистить и закрепить (нанести покровное стекло)

После окрашивания эозином предметное стекло пропускают через несколько смен спирта для удаления всех следов воды, затем промывают в нескольких ваннах с ксилолом, который «очищает» ткань и делает ее полностью прозрачной.Наносится тонкий слой полистирола, а затем покровное стекло. Если окрашивание и все последующие шаги были выполнены правильно, на слайде будут обнаружены все важные микроскопические компоненты, и он будет стабильным в течение многих лет.

Устранение неполадок с пятнами H&E

Хотя окрашивание H&E является относительно простым окрашиванием, существует множество артефактов, которые могут помешать хорошему окрашиванию.

Артефакты могут быть вызваны множеством причин.

Устранение неисправностей H&E Stains

Подготовка образцов тканей для гистологического исследования от пациента до патологоанатома требует осторожности, навыков и тщательных процедур. В этом руководстве представлены практические советы по передовым методам и простые способы избежать распространенных ошибок.

В этом разделе выделены советы по регулярному окрашиванию и получению покровных стекол. Мы надеемся, что каждый шаг станет ценным напоминанием о хорошей гистологической практике и поможет в устранении неполадок, когда все же возникают неприемлемые результаты.

Хотите увидеть все 101 шаг к лучшей гистологии?

Загрузите 101 шаг к лучшей гистологии прямо сейчас!

Каждый шаг в протоколе окрашивания точно рассчитан по времени.

Время этапов окрашивания приблизительное, «если мы торопимся», некоторые этапы пропускаются. Это может привести к противоречивым результатам.

Эти срезы были вырезаны из одного блока одинаковой толщины и вручную окрашены H&E разными сотрудниками с использованием того же метода.Даже макроскопически можно увидеть несостоятельность пятна.

Контрольные слайды регулярно окрашивают для контроля качества окраски.

Контрольные слайды никогда не используются для пятен H&E. Это может затруднить определение того, вызвана ли проблема окрашивания плохими реагентами, несоответствующим протоколом или плохой фиксацией.

Этот участок почки включает множество эозинофильных тканевых элементов и хорошо сохранившихся ядер, что позволяет надежно оценить качество окрашивания H&E.Плацента — это еще один тип образцов, который можно использовать в качестве полезного средства контроля.

Время перемешивания, стирки и слива оптимизировано для всех этапов окрашивания.

Время перемешивания, стирки и слива несовместимо. Растворители и реагенты быстро загрязняются. Окрашивание становится непостоянным.

Одним из преимуществ использования автоматического прибора для окрашивания является то, что время перемешивания, стирки и слива одинаковое. Если правильно контролировать другие переменные, это обеспечит хорошие и стабильные результаты.

Депарафинизация слайдов оптимизирована.

Депарафинизация предметных стекол иногда бывает неполной, и на предметных стеклах есть пятна остаточного воска. В результате на срезах образуются неокрашенные или неравномерно окрашенные участки.

На этом срезе, окрашенном H&E, видна большая неокрашенная область слева и несколько более мелких участков, которые либо частично окрашены, либо неокрашены. Это связано с неполным удалением воска перед окрашиванием.

Растворители и окрашивающие реагенты регулярно меняются в зависимости от количества окрашенных слайдов или обработанных стоек.

Замена растворителей и окрашивающих реагентов происходит бессистемно. Их не заменяют, пока качество пятна не ухудшится.

В этом разделе показано некачественное мутное окрашивание гематоксилином. Этот реагент следует немедленно заменить.

Предметные стекла тщательно гидратированы перед окрашиванием гематоксилином.

Раствор гематоксилина быстро загрязняется спиртом, а иногда и ксилолом. Это вызывает неравномерное окрашивание.

Неравномерное окрашивание гематоксилином, видимое в эпидермисе на этом участке кожи, было вызвано остаточным ксилолом (и следами воска), присутствующим при нанесении гематоксилина.

Эффективность растворов гематоксилина тщательно контролируется. В течение срока службы растворы гематоксилина постепенно разбавляются переносом с предметных стекол и штативов, а также подвержены продолжающемуся окислению.

Окрашивание гематоксилином

меняется изо дня в день, и мы не пытаемся понять, почему.Например, площадь поверхности окрашивающей ванны, степень аэрации во время окрашивания и температура окружающей среды могут влиять на скорость окисления.

Показаны два слайда из одного блока управления. Их окрашивали H&E с использованием идентичных протоколов на автоматическом окрашивателе, но с интервалом в семь дней между запусками. Даже макроскопически различия в уровне окрашивания очевидны.

После окрашивания гематоксилином всегда проводят тщательное «посинение» ядер щелочным заменителем водопроводной воды Скотта или аммиачной водой.На это требование влияет естественный pH водопроводной воды.

Иногда ядра выглядят розоватыми на завершенных срезах из-за неполного «посинения» в щелочной водопроводной воде после окрашивания гематоксилином. Ядра, неокрашенные гематоксилином (или сверхдифференцированные) и перекрашенные эозином, также выглядят розовыми.

A. На этом участке ядра эпидермиса плохо выражены и имеют розоватый цвет. Этот участок не был должным образом «воронен» в щелочной воде после окрашивания гематоксилином (кожа, H&E).
B. Это показывает другой участок, который был должным образом «воронен» после ядерной окраски. Здесь ядра выражены гораздо лучше (кожа, H&E).

«Посинение» сопровождается очень тщательной промывкой в водопроводной воде для удаления остаточной щелочи, которая может препятствовать окрашиванию эозина и вызывать слабое и неравномерное окрашивание.

Неэффективная стирка после «посинения» (оставления остаточной щелочи) вызывает слабое и неравномерное окрашивание эозином.

В этом разделе показано влияние остаточной щелочи на окрашивание эозином.Обратите внимание на пятнистый характер пятна (селезенка, H&E).

Контролируется pH раствора эозина. Его pH поддерживается близким к 5,0 для поддержания оптимального окрашивания. Добавление пары капель уксусной кислоты может использоваться как удобное средство снижения pH.

Не предпринимается никаких попыток контролировать pH эозина. Когда интенсивность окрашивания спадает, раствор заменяют (вынос щелочной водопроводной воды может вызвать повышение pH растворов эозина).

Срез легкого, окрашенного H&E. Пятно эозина всегда очень слабое и совершенно неприемлемое. Обратите внимание, что единственными компонентами, окрашенными эозином, являются эритроциты.

Срезы тщательно обезвоживаются перед помещением в ксилол для очистки.

Срезы иногда быстро пропускают через спирт в ксилол. Очистка в ксилоле, загрязненном водой, может привести к появлению крошечных капелек воды в ткани, которые под микроскопом будут видны как непрозрачные участки с недостаточной детализацией.

В этом разделе отсутствует четкость (невооруженным глазом он кажется непрозрачным). При внимательном осмотре обнаруживаются крошечные капельки воды, присутствующие по всему периметру.

Покровное стекло всегда наносится до того, как секция высохнет, и будет использовано высококачественное крепежное средство. Необходимо знать о свойствах среды при длительном хранении, поскольку кристаллы могут появиться в среде низкого качества, иногда через длительный период (месяцы или годы).

Срезы могут частично высохнуть перед нанесением покровного стекла, в результате чего некоторые ядра станут черными.Mountant, выбранный только на основании цены, может образовывать кристаллы во время длительного хранения, и покровные стекла могут подниматься.

A. Этому участку дали возможность частично высохнуть перед закрытием покровного стекла. Это привело к тому, что крошечные пузырьки воздуха застряли над некоторыми ядрами, что сделало их черными (иногда это называется «кукурузными хлопьями»).
B. Покровный срез, окрашенный H&E, демонстрирующий множество преломляющих сферокристаллов, которые образовались из некачественной среды в течение шести месяцев после монтажа.

Содержание Leica Biosystems Knowledge Pathway регулируется условиями использования веб-сайта Leica Biosystems, доступными по адресу: Legal Notice. Контент, включая вебинары, обучающие презентации и сопутствующие материалы, предназначен для предоставления общей информации по конкретным темам, представляющим интерес для специалистов здравоохранения, и не предназначен и не должен толковаться как медицинские, нормативные или юридические консультации. Взгляды и мнения, выраженные в любом стороннем контенте, отражают личные взгляды и мнения докладчиков / авторов и не обязательно представляют или отражают взгляды или мнения Leica Biosystems, ее сотрудников или агентов.Любые ссылки, содержащиеся в контенте, обеспечивающем доступ к сторонним ресурсам или контенту, предоставляются только для удобства.

При использовании любого продукта следует обращаться к соответствующей документации продукта, включая информационные руководства, вкладыши и руководства по эксплуатации. Leica Biosystems и редакторы настоящим отказываются от какой-либо ответственности, возникающей прямо или косвенно в связи с использованием содержания, в том числе в связи с любыми лекарствами, устройствами, методами или процедурами, описанными в содержании.

Copyright © 2021 Leica Biosystems, подразделение Leica Microsystems, Inc. и ее дочерних компаний Leica Biosystems. Все права защищены. LEICA и логотип Leica являются зарегистрированными товарными знаками Leica Microsystems IR GmbH.

Автоматический анализ иммуногистохимических изображений определяет возможные биомаркеры местоположения для рака

Значимость

Изменения в экспрессии белков часто связаны с онкогенезом и часто используются в качестве биомаркеров рака.Менее часто исследуются изменения в субклеточном расположении белков. В этой статье мы описываем надежный конвейер для идентификации тех белков, субклеточное расположение которых подвергается статистически значимым изменениям при раке четырех тканей, а также для идентификации биохимических путей, которые обогащены белками, которые перемещаются. Дальнейшие исследования этих белков и путей могут дать новое понимание онкогенеза. Кроме того, ожидается, что конвейер анализа будет полезен для оценки типа и тяжести заболевания в клинических условиях.

Abstract

Молекулярные биомаркеры — это изменения, измеренные в биологических образцах, которые отражают болезненное состояние. Такие маркеры могут помочь клиницистам идентифицировать типы рака или стадии прогрессирования, а также помочь в выборе конкретных методов лечения. Многие попытки идентифицировать биомаркеры рассматривают гены, которые мутируют между нормальными и злокачественными тканями, или изменения уровней экспрессии белка или РНК. Здесь мы определяем биомаркеры местоположения, белки, которые претерпевают изменения в субклеточной локализации, которые указывают на заболевание.Чтобы обнаружить такие биомаркеры, мы разработали автоматизированный конвейер для сравнения субклеточного расположения белков между двумя наборами иммуногистохимических изображений. Мы использовали конвейер для сравнения изображений здоровой и опухолевой ткани из Атласа белков человека, ранжируя сотни белков в груди, печени, простате и мочевом пузыре на основе оценки того, насколько изменилось их местоположение. Эффективность системы оценивалась путем определения того, были ли белки, которые, как было известно, изменяют локализацию в опухолях, были высоко оценены.Мы представляем ряд возможных биомаркеров местоположения для каждой ткани и идентифицируем биохимические пути, которые обогащены белками, которые меняют местоположение. Ожидается, что технология анализа будет полезна не только для обнаружения новых биомаркеров местоположения, но и для обеспечения возможности автоматического анализа распределения биомаркеров в качестве помощи при постановке диагноза.

Наше понимание количества и типов изменений, происходящих при различных формах рака, постоянно растет. В предыдущей работе по обнаружению белков, которые значительно различаются между нормальными и раковыми клетками, использовались такие методы, как профилирование микроматриц, секвенирование следующего поколения, массивы антител и протеомное профилирование (1–4).Эти исследования привели к открытию белков (называемых биомаркерами экспрессии), уровни экспрессии которых отмечают различные болезненные состояния. Однако для некоторых белков степень локализации в ядре может использоваться для прогнозирования прогноза пациента; β-катенин (5) и NF-κB (6) являются примерами. Открытие большего количества белков, которые претерпевают связанные с онкогенезом изменения в субклеточной локализации (которые мы называем биомаркерами местоположения), может потенциально улучшить диагностику заболеваний в сочетании с традиционными маркерами экспрессии белков.Кроме того, обнаружение белков, которые перемещаются в болезненном состоянии, может дать новое понимание изменений, ведущих к болезни, и такие изменения останутся незамеченными при измерении только экспрессии.

Исследования иммуногистохимии (ИГХ) являются основным источником данных об экспрессии и локализации белков. В большинстве таких исследований для оценки изменений используется визуальный осмотр — сложная и трудоемкая задача. С появлением высокопроизводительных технологий сбора данных, таких как тканевые микроматрицы и автоматические слайд-сканеры, очень желателен компьютеризированный анализ изображений тканей, и исследования показали, что количественное программное обеспечение может обнаруживать изменения в болезненных состояниях, которые не учитываются при визуальном осмотре (7).Методы анализа изменений экспрессии и паттерна хорошо известны в культивируемых клетках (8), но гистологические изображения обычно труднее анализировать, потому что клеточная гетерогенность и плотно упакованная организация клеток приводят к серьезным проблемам клеточной сегментации. Было инициировано несколько проектов по созданию рабочих процессов, обрабатывающих образы IHC (9, 10). Большая часть этой работы была сосредоточена на количественной оценке различий в содержании белка между нормальной и раковой тканями. Однако, как обсуждалось ранее, различия в расположении субклеточных белков также могут иметь решающее значение для понимания и диагностики заболевания.Таким образом, существует острая потребность в системах, которые могут анализировать субклеточное расположение белков на изображениях IHC.

Мы ранее описали автоматизированную систему для распознавания основных субклеточных паттернов на изображениях IHC (11) и представили предварительные результаты использования этой системы для идентификации белков, которые меняют местоположение при различных раковых заболеваниях (12). В этих исследованиях использовалась часть обширной коллекции изображений IHC в Атласе белков человека (HPA) (13). Тем не менее, мы обнаружили, что производительность на более крупном наборе белков с большим разнообразием паттернов была значительно ниже по сравнению с 16 белками-маркерами, используемыми в нашем предыдущем исследовании.Поэтому мы стремились разработать систему, которая может идентифицировать потенциальные биомаркеры местоположения с помощью новых подходов без явной классификации. Используя изображения из HPA, мы показываем, что наша система может идентифицировать белки с измененным субклеточным расположением непосредственно по изображениям тканей, и ожидаем, что такие подходы могут значительно способствовать диагностике, лечению и мониторингу рака.

Результаты

Наш конвейер анализа (рис. 1) состоит из пяти этапов.

i ) Выбор набора белков для анализа на основе уровней окрашивания.Для данной ткани мы выбрали антитела из HPA, интенсивность окрашивания которых была обозначена как умеренная или сильная, а степень окрашивания которых была обозначена как более 75%. В результате тканеспецифической экспрессии и вариаций окрашивания идентифицированные белки (называемые набором для анализа) были разными для каждой ткани.
ii ) Разделение компонентов ДНК и белка каждого изображения путем разделения красителей гематоксилина и диаминобензидина. Изображения HPA были собраны как красные, зеленые и синие (RGB) изображения, на которых два пятна выглядят как пурпурные и коричневые соответственно.Таким образом, интенсивность каждого пятна представляет собой комбинацию интенсивностей трех каналов RGB. Мы разложили спектры, чтобы получить отдельные изображения, отражающие в основном содержание ДНК и белка (11).
iii ) Выбор областей каждого изображения с наивысшей экспрессией белка, исходя из предположения, что наиболее окрашенные области с меньшей вероятностью будут содержать соединительную ткань, строму и другие неклеточные области.
iv ) Вычисление признаков для описания шаблонов местоположения в каждом регионе (11).
v ) Во-первых, оценка вероятности того, что паттерн местоположения данного белка различается в этих двух условиях. Непараметрический критерий Фридмана-Рафски (FR) был использован для вычисления значения P для нулевой гипотезы о том, что наборы областей из нормальных изображений и из изображений рака показывают одинаковый образец. Во-вторых, оценка вероятности того, что уровень экспрессии данного белка различается в этих двух условиях. Значения экспрессии P были рассчитаны с использованием метода Вальда-Вулфовица для проверки нулевой гипотезы о том, что уровень экспрессии в областях нормального изображения и изображения рака происходил из одного и того же распределения.Расчеты для 35 случайных выборок изображений были усреднены, что дало очень высокую повторяемость результатов ( Материалы и методы, ). Наконец, расчет точности классификации для разделения нормальных изображений и изображений рака с использованием информации о местоположении белков.

Рис. 1.

Обзор конвейера обнаружения биомаркеров местоположения. Были выбраны изображения с сильным или умеренным окрашиванием антител. Линейное разделение использовалось для разделения каждого изображения на два составных изображения, представляющих пятна ДНК и белка, как описано ранее (11).Области были выбраны путем свертки изображения белка с помощью фильтра нижних частот и выбора самых высоких точек в качестве центров областей. Для описания модели в каждом регионе было вычислено пятьдесят семь числовых характеристик. Непараметрический тест FR использовался для вычисления значения P и определения того, следует ли отвергать нулевую гипотезу о том, что признаки нормального изображения и изображения рака происходят из одного и того же распределения. Непараметрический тест Вальда – Вольфовица использовался для расчета значения P , чтобы измерить, насколько вероятно, что два набора изображений будут происходить из одного и того же распределения выражений.Классификатор ближайшего соседа также использовался для определения способности каждого антитела различать нормальные изображения и изображения рака.

Мы применили этот конвейер к изображениям из HPA для четырех тканей: груди, печени, простаты и мочевого пузыря (результаты содержатся в наборе данных S1). После запуска конвейера для каждой ткани белки были отсортированы по значениям P их местоположения, чтобы получить ранжирование по степени изменения субклеточного местоположения. Репрезентативные изображения трех основных попаданий для каждой ткани показаны на рис.S1.

Тестирование с использованием биомаркеров известного местоположения.

Мы ожидали, что белки, о которых известно, что они меняют место при раке, будут занимать в этом списке первое место. Чтобы проверить это, мы создали наборы для валидации, используя аннотации патологов к общему субклеточному расположению, предоставленные в HPA: ( i ) ядерная, ( ii ) цитоплазма и плазматическая мембрана, ( iii ) ядерная, цитоплазматическая и плазменная мембрана и ( iv ) нет. Набор для валидации для данной ткани состоял из тех белков из набора для анализа для этой ткани, у которых были разные аннотации местоположения между нормальным изображением и изображением рака ( Материалы и методы, ).Рассматривая их как истинно положительные, мы построили кривые рабочих характеристик приемника (ROC), в которых варьировалось пороговое значение для значения P , при котором белок считался положительным (рис. S2). В этом случае площадь под кривой (AUC) является мерой того, насколько хорошо наш тест находит истинные положительные результаты. Если маркеры валидации были единственными белками, которые, как ожидается, изменили местоположение, и если система работала идеально, значения AUC должны быть 1. Однако мы ожидаем, что некоторые из белков с высоким рейтингом по значению P могут быть фактическими биомаркерами местоположения, даже если они не входят в набор для проверки.Например, белки могут претерпевать изменение местоположения, которое не было зафиксировано общими аннотациями местоположения, используемыми для определения истинных положительных результатов. Таким образом, мы не ожидаем, что даже очень хорошая система обнаружения даст значения около 1. Значения AUC для груди, печени, простаты и мочевого пузыря составили 0,67, 0,59, 0,67 и 0,68 соответственно. Все они значительно больше 0,5, AUC, ожидаемого для случайной производительности.

Отличительные изменения местоположения и выражения.

Используемые нами функции призваны минимизировать влияние различий в уровне окрашивания белков.Даже в этом случае серьезное изменение выражения может вызвать изменение текстуры изображения, которое будет обнаружено нашими функциями, даже если субклеточное расположение остается прежним. Это может привести к тому, что белки, которые существенно не изменяют свое местоположение, но резко меняют свою экспрессию, занимают высокие позиции в наших списках. Поэтому мы использовали значения выражения P и значения местоположения P вместе, чтобы проанализировать изменение каждого белка.

Фиг. 2 показывает взаимосвязь между изменением экспрессии и изменением местоположения белков в различных тканях.Первый вывод, который мы можем сделать, заключается в том, что эти два значения не коррелируют, что позволяет предположить, что белки, которые меняют местоположение, не всегда изменяют экспрессию, и наоборот. Во-вторых, точки в верхнем левом углу каждой диаграммы разброса на фиг. 2 представляют белки, которые значительно изменили местоположение (низкие значения P ), но не изменили экспрессию (высокие значения P ). Цвет каждой точки указывает, насколько хорошо этот белок можно использовать для обучения классификатора различению изображений нормальной и раковой ткани ( Материалы и методы ; значения точности перечислены в наборе данных S1).Таким образом, мы ожидаем, что белки, символы которых темно-красные и в верхнем левом углу, будут потенциальными биомаркерами, полезными в клинических условиях для распознавания раковой ткани путем измерения различий в субклеточном расположении. Эти белки нельзя было бы идентифицировать как потенциальные маркеры только путем измерения изменений экспрессии. Набор данных S1 ранжируется для каждой ткани с использованием евклидова расстояния от верхнего левого угла, то есть белков, которые меняют местоположение и не изменяют экспрессию. Пять лучших белков для каждой ткани с использованием этого критерия показаны в таблице 1, а изображения трех лучших белков для каждой ткани показаны на рис.3.

Рис. 2.

Различение изменений интенсивности и местоположения. Каждая точка показывает значения P для гипотез о том, что местоположение или экспрессия различны в нормальной и опухолевой тканях для данного белка. Корреляция между локализацией и значениями экспрессии P является слабой, что позволяет предположить, что белки, которые меняют местоположение в состоянии рака, не обязательно изменяют экспрессию, как видно в верхнем левом углу. Цвет указывает на точность классификации для разделения нормальных и раковых изображений этого белка с использованием только информации о субклеточном расположении.Белки с высокой точностью классификации для различения нормальных изображений и изображений рака представлены красной точкой. Красные белки, расположенные ближе всего к левому верхнему углу, являются потенциальными биомаркерами местоположения, и их открытие было бы упущено традиционными экспериментами, измеряющими изменения в экспрессии белков.

Таблица 1.

Возможные биомаркеры местоположения

Рис. 3.

Примерные области из прогнозов биомаркеров верхнего местоположения с очень небольшими изменениями средней интенсивности. Для каждого белка признаки каждого болезненного состояния были сгруппированы с использованием k -средних ( k = 2), и отображалась область, ближайшая к каждому центроиду.

Конечно, мы ожидали, что классические биомаркеры, которые, как известно, перемещаются при раке, такие как E-кадгерин, β-катенин и NF-κB, будут занимать высокое место в этом списке. Эти белки не были частью наших наборов для анализа, потому что HPA не содержал достаточного количества изображений, чтобы соответствовать порогу нашего конвейера. Поэтому мы отдельно рассчитали значения местоположения P для этих белков, используя изображения, которые были доступны для рака груди и простаты. Значения P для двух антител к E-кадгерину с высокой надежностью, CAB000087 и HPA004812, были выше 0.20. Значения P для трех антител к β-катенину, CAB000108, HPA029159 и HPA029160, были выше 0,32. Два антитела против NF-κB при раке простаты — это CAB004031 и HPA027305 со значениями P , превышающими 0,22. Таким образом, наши тесты показывают, что ни один из них не является сильным биомаркером местоположения в этих тканях, вопреки ожиданиям, основанным на предыдущих литературных отчетах. Кроме того, при визуальном осмотре изображений HPA мы не наблюдали изменения картины; аннотации патологоанатома также не указали на изменение местоположения.Все антитела для этих трех белков имели идентичные аннотации местоположения в двух болезненных состояниях, за исключением HPA004812, который переместился из ядерной, цитоплазматической и мембранной в преимущественно цитоплазматическую мембранную в состоянии рака. Причина отличия этого набора данных от предыдущих результатов неясна.

Учитывая, что мы оценивали большое количество антител, нас также интересовала возможность обобщения относительной эффективности антител.Другими словами, насколько вероятно, что белки с низкими значениями P или высокой точностью классификации будут показывать аналогичные значения в будущих экспериментах? Для этого мы вычислили значения P и точности для меньшего количества изображений и сравнили их со значениями с большим числом ( SI Text ; обратите внимание, что это отличается от повторяемости ранжирования с использованием того же количества изображений. изображений). Результаты, показанные на рис. S3, указывают на высокую корреляцию между двумя оценками, указывая на то, что возможность обобщения наших результатов для будущих экспериментов должна быть высокой.

Особенности выявляют визуально отличимые изменения, полезные для отличия опухоли от здоровой ткани.

Чтобы определить, были ли различия в местоположении, идентифицированные нашим конвейером, визуально различимыми изменениями, мы выполнили иерархическую кластеризацию и оптимальное упорядочение листьев, чтобы упорядочить области для данного антитела, используя наши особенности ( Материалы и методы ). На фиг. 4 показаны 10 репрезентативных областей, упорядоченных для двух примерных белков из белков с самым высоким рейтингом.В ткани груди, окрашенной на SLC36A4, нормальные области сгруппированы рядом друг с другом слева. Кроме того, области кажутся упорядоченными за счет увеличения ядерной локализации, предполагая, что наши особенности могут обнаруживать постепенные и, возможно, непрерывные изменения в этом паттерне локализации. В печени GSTZ1 показал уменьшение ядерной локализации слева направо, а также увеличение зернистости цитоплазмы. При кластеризации отдельно сгруппированы нормальные и раковые области.

Рис. 4.

Сортировка регионов по прогрессии смены локации.Мы выбрали один из белков груди и печени, занимающих первое место: антитела HPA017887 и HPA004701 соответственно. Евклидовы расстояния между каждой парой регионов были рассчитаны с использованием функций и сгруппированы в бинарное иерархическое дерево. Листьям было приказано максимизировать сумму сходства между соседними листьями по всему дереву. Дерево было разрезано на 10 кластеров, и листья, содержащиеся в каждом кластере, обозначены цветом. Область, ближайшая к среднему для каждого кластера, отображается под деревом слева направо.Обычные плитки обведены синим цветом; раковые плитки обведены красным.

Локальные биомаркеры позволяют различать степень рака.

Каждый рак в HPA имеет определенную степень или подтип. Мы разделили изображения по степени и запустили конвейер, чтобы сравнить две степени друг с другом для набора данных рака простаты и мочевого пузыря (набор данных S2). Мы также спросили, насколько хорошо каждый белок можно использовать в качестве потенциального биомаркера в классификаторе, обученном различать три болезненных состояния: нормальные ткани и опухоли низкой и высокой степени злокачественности.Фиг. S4 показывает значение местоположения P и значение выражения P для каждого белка при сравнении двух подтипов друг с другом. Точки, которые попадают в верхний левый угол (рис. S4), имеют разные субклеточные местоположения между двумя уровнями, но схожие уровни экспрессии. Цвет каждой точки показывает точность классификации этого белка по трем классам.

Примеры изображений белков с наибольшей точностью классификации по трем классам показаны на рис.S5. Наилучшая точность классификации была получена для S100A6 в мочевом пузыре: он имеет точность классификации 83% (по сравнению с 33%, ожидаемыми случайным образом), значение местоположения P , равное 0,081, и значение выражения P , равное 0,34. Этот белок является лучшим примером потенциального биомаркера местоположения (который меняет местоположение, но не экспрессию) в мочевом пузыре. Эти результаты дополнительно подтверждают полезность нашей системы для выявления важных изменений местоположения между болезненными состояниями.

Идентификация биохимических путей, обогащенных транслоцированными белками.

Наконец, нам было интересно выяснить, может ли наш анализ предложить целые пути или их основные части, которые могут подвергаться транслокации вместе при раке (простейшим примером могут быть белки, которые являются частью транслокационного комплекса). Чтобы ответить на этот вопрос, для каждого пути Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) мы рассчитали вероятность того, что все белки в нем изменили местоположение или экспрессию по сравнению со случайно выбранным фоновым распределением ( SI Text и рис.S6). (Обратите внимание, что это представляет собой недооценку изменения пути, если он содержит субкомпоненты, которые не перемещаются.) Мы рассчитали изменения пути, используя наш конвейер обработки изображений или аннотации патологоанатома. Пути с наибольшим изменением локализации или экспрессии перечислены в Таблице 2. Как обсуждается ниже, некоторые из этих путей ранее были вовлечены в развитие рака, а некоторые являются новыми предсказаниями.

Таблица 2.

Пути с наибольшими изменениями местоположения или экспрессии

Обсуждение

Мы описали рабочий процесс для идентификации белков, которые меняют свое субклеточное положение между нормальной и злокачественной тканью, не требуя классификации.Мы подтвердили нашу способность обнаруживать изменения в классах местоположения с помощью аннотаций, предоставленных базой данных HPA.

При визуальном осмотре лучших результатов (рис. 3) мы отметили, что наша система смогла обнаружить изменения текстуры между двумя болезненными состояниями; однако они не всегда представляли изменения между отдельными классами субклеточной локализации. В некоторых случаях наши текстурные особенности выявляли изменения в структуре и морфологии тканей.

На рис. 3, BTNL2 в груди показывает уменьшение ядерной локализации.SLC30A9 в печени уменьшился в цитоплазматической зернистости, а C4orf22 уменьшился в плазматической мембране и локализации везикул в состоянии рака. При раке простаты ECE1 снижает накопление плазматической мембраны. При раке мочевого пузыря FGFR1OP2 изменился с цитоплазматической и ядерной локализации на преимущественно зернистую цитоплазматическую локализацию при раке. TARS2 в мочевом пузыре увеличивает локализацию ядерной мембраны при раке. В некоторых случаях наши особенности текстуры улавливают изменения в структуре ткани, но не обязательно внутриклеточное расположение, как это было видно в SCRN2 в груди и TTC27 в мочевом пузыре.

Было интересно рассмотреть, предполагалось ли ранее, что наши главные предсказания повлияли на развитие рака, и какие из них были новыми открытиями. При раке груди очень мало исследований сообщали о BTNL2; однако есть убедительные доказательства того, что варианты этого гена играют роль в предрасположенности к спорадическому и семейному раку простаты (14). О PSTPIP2 не сообщалось при раке груди; однако он участвует в распространении предшественников макрофагов, что приводит к аутовоспалительному заболеванию (15).USP10 перемещается в ядро при повреждении ДНК и регулирует p53 (16).

Сообщается, что при раке печени PARP12 играет роль в надзоре за геномом и путях репарации ДНК, и он признан новой потенциальной терапевтической мишенью (17).

Что касается рака простаты, то три из наших основных результатов связаны с развитием рака простаты. Было обнаружено, что метилирование гена RASGRF2 связано с раком простаты (18). ECE1 участвует в инвазии клеток рака предстательной железы, при этом было обнаружено, что разные изоформы белка играют разные роли (19).PLA2G4C регулируется EGR, геном, который перестраивается примерно в 50% случаев рака простаты (20). Что касается рака мочевого пузыря, то очень немногие из основных результатов были опубликованы в связи с заболеванием.

Изменения в пути.

Некоторые из путей наивысшего ранга имели значения местоположения P , которые были примерно на два порядка меньше, чем значения выражения P , основанные на результатах конвейера (таблица 2 и рис. S6). В пути заражения HTLV-1 онкобелок HTLV-I Tax инициирует развитие злокачественных новообразований при лейкемии, создавая среду, способствующую повреждению ДНК (21).Насколько нам известно, молекулярный механизм этого пути не изучался в контексте рака груди или уротелиального рака. Наши результаты вместе с другими литературными сообщениями показывают, что изменения внутриклеточной локализации компонентов пути заражения HTLV-I могут играть роль в развитии рака. Кроме того, высокий ранг этого пути в четырех тканях указывает на то, что эти изменения могут быть важны также для выявления и понимания других видов рака.

Было также обнаружено, что путь «один пул углерода за счет фолиевой кислоты» изменяет свое местоположение при раке груди.Известно, что он играет важную роль в глобальном гипометилировании ДНК, которое может приводить к разрывам цепи ДНК (22). Как и ожидалось, когда изменения в экспрессии используются для ранжирования путей, путь ErbB занимает одно из первых мест для рака груди (23).

Было обнаружено, что при раке печени путь наведения аксонов изменяет локализацию в большей степени, чем экспрессию. Было обнаружено, что один из генов, участвующих в пути наведения аксонов, ROBO1, сверхэкспрессируется при гепатоцеллюлярной карциноме (24). Путь наведения аксонов в целом не участвует в развитии рака печени, но, как известно, он изменяется при раке поджелудочной железы (25).Наши результаты с предыдущими сообщениями о ROBO1 предполагают, что этот путь может играть роль в развитии рака печени. Важность основных путей изменения экспрессии в печени неясна.

Известно, что при раке простаты передача сигналов HIF-1 играет важную роль в адаптации опухолей к гипоксии, а HIF-1α, как известно, сверхэкспрессируется в ранних опухолях (26). Наши результаты предполагают, что белки этого пути претерпевают изменения местоположения, что, возможно, способствует нарушению регуляции пути при раке.PPAR является известным маркером рака простаты (27), и его путь идентифицирован как изменение экспрессии.

Наконец, при уротелиальном раке сигнальный путь гиппопотама был ведущим путем изменения местоположения. Передача сигналов Hippo отвечает за размер ткани и, как известно, приводит к неконтролируемой клеточной пролиферации и блокированию апоптоза при неправильной регуляции (28). Когда мы ранжировали пути развития уротелиального рака по изменениям экспрессии, ряд сигнальных путей, которые, как известно, участвуют в раковых заболеваниях, заняли первое место.

Мы также вычислили произведение значений P для каждого пути во всех четырех тканях, чтобы найти эти пути, изменяющиеся во всех четырех формах рака (набор данных S3). Три основных пути изменения местоположения уже были идентифицированы в отдельных тканях. Кроме того, был идентифицирован сигнальный путь p53 (который, как известно, связан с изменением местоположения). Что касается изменений экспрессии, пять путей, ранее связанных с раком, получили высокую оценку (что обнадеживает с точки зрения точности наших автоматизированных методов).

Наш анализ показывает, что изменение местоположения этих путей может иметь важное значение для понимания их роли в развитии болезни. Кроме того, наши результаты связывают ранее выявленные пути к новым видам рака для дальнейшего изучения.

Заключение

Используя образцы окрашивания белков в четырех тканях, мы идентифицировали белки, которые показывают измененное субклеточное расположение при раке и / или чьи образцы могут быть использованы для различения нормальной и раковой ткани или различных подтипов рака.Многие из этих белков не имеют значительных изменений уровня экспрессии и не были бы обнаружены в качестве биомаркеров, если бы мы рассматривали только изменения уровня экспрессии. Кроме того, некоторые белки обладают высокой точностью классификации, но визуально схожими схемами расположения. Обнаруживаемые тонкие изменения, тем не менее, могут быть полезны для различения болезненных состояний. Расширенный анализ с большим количеством изображений потенциальных маркеров, которые мы идентифицировали, будет необходим для оценки их полезности или значимости.Мы отмечаем, что описанный нами конвейер анализа полезен не только для идентификации биомаркеров рака, но также должен быть ценным для автоматизации процесса анализа изображений IHC для оценки состояния болезни. В настоящее время мы проводим совместные трансляционные исследования, чтобы определить, пригодна ли наша технология в сочетании с какими-либо потенциальными биомаркерами для различения поражений с различными диагнозами или прогнозами.

Материалы и методы

Данные.

Мы использовали изображения из HPA (www.proteinatlas.org), который появился в сети 24 сентября 2013 г. (см. рис. S7 для оценки эффектов сжатия изображения). Белки были помещены в набор для анализа для каждой ткани, если они соответствовали трем критериям: ( i ) аннотация окрашивания была сильной или умеренной, ( ii ), если поле количества было аннотировано как более 75%, и ( iii ) по крайней мере три изображения этого белка были доступны для нормальной ткани. Приблизительно 500 белков на ткань прошли эту процедуру фильтрации (набор данных S1 предоставляет список белков в полном наборе анализа для каждой ткани).

Идентификация проверочных наборов.

Проверочный набор белков, местоположение которых, как известно, изменилось (что мы определяем как истинно положительные), был создан для каждой ткани. Они были найдены с помощью аннотаций HPA. Мы определили набор истинно положительных результатов для данной ткани, найдя те белки, для которых набор аннотаций местоположения для всех нормальных изображений не пересекался с набором аннотаций местоположений для всех изображений рака. В наборе данных для груди, печени, простаты и мочевого пузыря было 5, 3, 7 и 13 истинных положительных результатов соответственно.

Выбор регионов.

Для каждого изображения мы выбрали области, которые показали значительное окрашивание. К каждому изображению белка был применен фильтр нижних частот, и мы выбрали области, центрированные на пиках отфильтрованного изображения. Это было сделано в предположении, что клеточные области ткани будут иметь самые высокие уровни окрашивания, в отличие от соединительной ткани, стромы и других неклеточных областей, которые будут иметь гораздо более низкие уровни окрашивания, прежде всего в результате неспецифического связывания антител. .

Удаление необычных изображений.

Затем мы удалили выпадающие области и изображения на основе интенсивности ДНК и белка. Для каждой ткани мы рассчитали среднее значение и стандартное отклонение окрашивания белка и ДНК для всех изображений. Этот же процесс повторяли для всех областей каждой ткани. Мы удалили изображения и области из набора данных, которые были более чем на 4 SD от среднего.

Конвейер для тестирования изменений местоположения или выражения.

Наш конвейер вычисляет значений P для гипотез о том, что расположение или экспрессия каждого белка одинаковы для нормальных изображений и изображений рака.Конвейер требует входных данных для количества используемых изображений, количества регионов для выбора для каждого изображения, размера области и количества оценок для усреднения при сообщении значений P и точности (выбор этих параметров обсуждается позже).

Для определения местоположения набор функций, которые не требуют сегментации изображения на отдельные области ячеек, был извлечен из каждой области, как описано ранее (11), с той модификацией, что горизонтальные и вертикальные функции были объединены для создания набора 592 инвариантные к вращению особенности.К ним относятся особенности текстуры на многих различных уровнях разрешения и особенности ядерного перекрытия. Мы использовали подмножество из 57 признаков, которое было ранее выбрано, чтобы иметь возможность различать восемь классов субклеточного местоположения с высокой точностью (ссылка 11; см. Также рис. S8). Эквивалентность распределений этих признаков для нормальных и злокачественных областей оценивали с помощью теста FR. Поскольку тест является непараметрическим и не делает предположений о распределениях, из которых взяты образцы, он подходит для небольшого количества регионов и большого количества объектов.

Expression Значения P рассчитывали путем нормализации среднего уровня интенсивности белка в каждой области, используемой в локальном анализе, на соответствующий средний уровень ядерной интенсивности. В результате получается одномерный набор точек, соответствующих областям нормальной экспрессии белка и экспрессии ракового белка. Мы вычислили значение P , чтобы точки в двух наборах были взяты из одного и того же распределения с помощью теста Вальда – Вольфовица, одномерной версии теста FR.

Сообщенные значения P и точность для каждого белка были рассчитаны путем взятия среднего из 35 оценок, которые, как мы обнаружили, дали согласованные ранжированные списки ( SI Text и рис. S9).

Выбор наборов изображений, количества областей и размера области.

База данных содержит до 3 изображений для каждой нормальной ткани и до 30 изображений для каждой раковой ткани. Чтобы иметь такое же нулевое распределение для непараметрических значений P , нам нужно было использовать одинаковое количество нормальных изображений и изображений рака для каждого антитела.Чтобы определить оптимальное количество каждого из них, мы случайным образом выбрали 200 антител для каждой ткани, выбрали 2 области из каждого изображения и оценили степень, в которой маркеры проверки были высоко оценены по значениям местоположения P (с использованием AUC). Количество нормальных изображений варьировалось от 1 до 3, а количество изображений рака — от 3 до 24. Мы обнаружили, что наилучшее среднее значение AUC для всех 200 антител было получено при использовании 2 нормальных изображений и 17 изображений рака.

Затем было найдено оптимальное количество областей с использованием того же обучающего набора из 200 антител и 2 нормальных изображений и 17 изображений рака.Мы варьировали количество регионов от 2 до 5 для каждого изображения. Наилучшая производительность, измеренная с помощью AUC, была получена при использовании 5, 3, 3 и 4 областей на изображение для тканей груди, печени, простаты и мочевого пузыря, соответственно, и поэтому мы использовали эти значения для полных наборов анализов. Различия в оптимальном количестве областей для разных тканей предположительно отражают тканеспецифические вариации в нормальном и злокачественном состояниях. Ограничение количества областей на изображение предотвращает выборку неклеточных областей в каждой ткани.

Оптимальный размер области был выбран путем оценки эффективности 100 случайно выбранных белков на кривых ROC для каждой ткани. В идеале область должна быть достаточно маленькой, чтобы захватывать только клеточные области из изображения ткани, так как захват неклеточных областей вводит в анализ новые текстуры, которые могут повлиять на особенности субклеточного местоположения. Оптимальный размер был выбран равным 75 пикселей со средней AUC 0,67 для четырех тканей.

Классификация.

Мы использовали классификаторы ближайшего соседа с признаками 57 z и использовали перекрестную проверку для оценки способности данного белка отличать нормальные изображения рака от изображений рака или отличать изображения рака низкой степени злокачественности от изображений высокой степени злокачественности.Изображениям был присвоен класс большинства своих регионов.

Определение степени рака.

Рак предстательной железы и мочевого пузыря определяется в HPA как высоко- или низкоуровневый, с примерно равным количеством каждого. Мы разделили изображения рака по степени и запустили конвейер для их сравнения. Мы также случайным образом выбрали три изображения из каждого набора и рассчитали точность классификации по трем классам для классификатора ближайшего соседа (с использованием перекрестной проверки с исключением одного).Это было повторено 35 раз (с получением последовательного ранжирования, как объяснялось ранее) для различных наборов случайно выбранных изображений, и сообщается среднее значение из 35 значений точности. Белки, у которых не было по крайней мере трех изображений от каждого болезненного состояния, были исключены. Результаты содержатся в наборе данных S2.

Благодарности

Мы благодарим команду проекта HPA за то, что ценная коллекция изображений IHC стала общедоступной; Э. Лундгрену и М. Улену за полезные обсуждения; сотрудники лаборатории Р.F.M. за ценные предложения; и анонимные рецензенты рукописи для комментариев, приводящих к значительным улучшениям в анализе. Эта работа была поддержана грантом NIH GM075205, учебным грантом NIH EB009403 (для A.K.), грантом 4100059192 Универсальной программы улучшения исследований Содружества Пенсильвании и постдокторской стипендией программы Lane Fellows Program (для A.R.).

Сноски

Вклад авторов: A.K., A.R., and R.F.M. спланированное исследование; А.К., А.Р., С.Б., Дж.Й.Н., Р.Ф.М. проведенное исследование; А.К., А.Р., Р.Ф.М. проанализированные данные; и А.К., А.Р., Р.Ф.М. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS. J.W.G. Приглашенный редактор по приглашению редакционной коллегии.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1415120112/-/DCSupplemental.

GBI Labs | Наборы для двойного и тройного окрашивания сверхчувствительного полимера HRP и AP, полимера

Наборы для многоцветного окрашивания полимера HRP и AP (небиотин)
Многоцветное окрашивание позволяет просмотреть 2-3 целевых белка на одном срезе ткани.Наборы Polink-DS (двойное окрашивание) GBI Labs обнаруживают практически любые две комбинации первичных антител. Некоторые наборы специально разработаны для проверки коэкспрессии в одном и том же месте среза ткани.
Наборы Polink-TS (тройное окрашивание) GBI Labs позволяют обнаружить 3 антигена за 5-6 часов. По желанию заказчика можно выбрать две комбинации цветов (коричневый / зеленый / красный или коричневый / красный / черный).
Многократное окрашивание тканей человека
Многократное окрашивание тканей животных

Наборы для обнаружения полимеров HRP и AP (небиотиновых)
GBI Labs предоставляет высококачественные полимерные (небиотиновые) наборы для обнаружения первичных антител мышей, кроликов, коз, крыс, кур, овец, армянских хомяков и морских свинок.Все вторичные антитела, используемые в нашей системе обнаружения, имеют высокую степень очистки. Комплекты Полинк-1 (полимер в 1 этап) обеспечивают быстрое выполнение заказа. Комплекты детектирования Полинк-2 (двухступенчатый полимер) и Polink-2 Plus (двухступенчатый полимер) обеспечивают наилучшее соотношение сигнал / шум. Посмотреть Полимер HRP и AP для тканей человека

Наборы для определения высокой специфичности тканей грызунов
В наборах сверхчувствительных полимеров GBI Labs HRP и AP используются новейшие полимерно-конъюгированные вторичные антитела и запатентованный блокирующий буфер для обнаружения антител мыши на ткани мыши, антитела крысы на ткани крысы, антитела крысы на ткани мыши или антитела мыши на ткани крысы с очень чистым фоном .Просмотр Polymer HRP AP для обнаружения тканей животных

IHC Gallary

Новые продукты

Набор для обнаружения человека на человеке — Наборы для обнаружения человеческих полимеров Klear от GBI Labs могут обнаруживать человеческие антитела на тканях человека без фона. Этот продукт без биотина обеспечивает отличную чувствительность и высокую специфичность — подробнее …

Сверхчувствительный Никель DAB — Обеспечивает резкое черное изображение, идеально подходящее для однократного, двукратного или трехкратного окрашивания.