Окрашивание техника: Виды и техники окрашивания волос — Сеть салонов красоты Naturel Studio

Виды и техники окрашивания волос — Сеть салонов красоты Naturel Studio

Оттенок волос может радикальным образом изменить ваш внешний вид, причём независимо от выбранной колористом техники окрашивания. Именно по этой причине для столь серьёзного изменения стиля стоит подготовиться заранее. Ниже описаны все основные техники окрашивания.

Вдохновение для выбора стиля окрашивания

Придумать, какие цвета сочетать для вашей новой причёски можно самостоятельно, перебрав несколько уже известных вариантов. Однако ещё больше вариантов находят в социальных сетях, ведь именно там модницы и модники делятся со своими друзьями и подписчиками новостями из своей жизни. В любом случае быть в тренде и знать о последних веяниях моды никогда не помешает. Полистав странички с последними постами Инстаграма, вы получаете возможность наткнуться на оригинальный стиль окрашивания.

Стильные, модные техники окрашивания

Сейчас самыми модными техниками окрашивания являются всевозможные естественные виды мелирования, контрастные окрашивания. Они добавляют волосам видимого объёма и создают многогранную разноцветную палитру на локонах.

Балаяж

Несмотря на то, что техника балаяж-мелирования сейчас только осваивается модницами, она была популярна ещё в восьмидесятых годах. Особенность этого вида окрашивания: подбор цветовых переливов осуществляется индивидуально для каждого клиента с учётом длины волос, овала лица, формы стрижки, а также тона кожи. Интересно, что мастер-колорист наносит краску либо осветлитель в данном случае с помощью кисти свободным методом, то есть так, как он считает нужным. В результате корни остаются натуральными, а на остальной части волос играют тёмные и светлые блики.

Неоспоримым «плюсом» этого окрашивания является натуральность цвета корней, так как при отрастании разницы не видно. При этом можно добавить и смешать оттенки в любое время, сделав внешне волосы ещё более густыми.

Шатуш

Шатуш – это техника окрашивания, которая производится с помощью начёсывания локонов. Внешне она очень похожа на предыдущий вариант. Особенностью является неравномерное нанесение краски, что создаёт эффект естественного цвета с мягкими, деликатными переходами. Начёсывание позволяет переходить от балаяжа к шатушу, а также помогает избегать «полосатого» эффекта.

Вывод: если вы хотите натуральный эффект слегка выгорающих на солнце волос с естественным цветом корней, выбирайте шатуш.

Омбре

Техника омбре-мелирования отличается резким и ярким переходом от тёмного цвета у корней к светлому на кончиках волос. Специалисты также называют этот вид окрашивания «растяжкой цвета» или градиентом. Эффектнее всего омбре выглядит на шевелюре из длинных волос, хотя средней длины локоны также подвергают такой покраске. Вариантов перехода масса: не обязательно делать чёрно-белые оттенки, можно поэкспериментировать, выбрав светло-розовый и мятный оттенки.

Мраморное окрашивание

Если радикальное осветление пока ещё пугает вас, мраморное окрашивание подойдёт, так как второстепенный оттенок (в отличие от главного) наносят всего лишь в нескольких местах. Главное – выбрать оба оттенка краски из одной цветовой палитры. В итоге получается как бы разложение одного цвета на несколько оттенков. Выгоднее всего мраморное окрашивание выглядит на не очень светлых или тёмных волосах, хотя жгучие брюнетки и светлые блондинки тоже могут удачно осуществить эксперимент «мраморной покраски» при обращении к специалистам Naturel Studio. Они выполнят деликатный рисунок, без видимых переходов, как это бывает при обыкновенном мелировании.

Какие цвета выбирают современные модницы

Разброс оттенков и цветов красок для волос поражает воображение, но как подобрать самые модные и подходящие именно вам оттенки? Конечно, наиболее смелые в самовыражении красавицы выбирают яркие, кричащие цвета краски.

Холодные оттенки для окрашивания волос

По прежнему в этом году актуальны стальные, металлические нотки на локонах, ведь они выглядят строго и выгодно оттеняют, обрамляют лицо. Проще всего приобрести желаемый светлый холодный оттенок блондинкам и девушкам, имеющим от природы нетёмный тон волос: в таком случае травмироваться и высушиваться волосы будут минимально. Однако брюнетки также могут осуществить полное изменение цвета у профессионального колориста.

Тёплые тона и оттенки для вашей шевелюры

Так называемые тёплые оттенки являются наиболее естественными, в отличие от вышеописанных холодных металлических цветов. Именно по указанной причине у естественного «тёплого» окрашивания очень много поклонников. Удачно подобранный цвет сможет выгодно оттенить волосы изначально рыжих, светловолосых или тёмноволосых дам.

На окрашивании «тигровый глаз» стоит остановиться более подробно. Название этого способа создания стиля происходит от природного минерала, имеющего золотистый оттенок и коричневатые полосочки. Чаще всего такое окрашивание делают темноволосые девушки, но на светловолосых «тигровый глаз» также будет отлично смотреться. При этом одинаково привлекательно будут переливаться оттенками после покраски вьющиеся, прямые, короткие, длинные локоны.

Так как данный вид парикмахерского преображения не выходит в своей цветовой гамме за пределы естественных оттенков, он будет естественно смотреться, значит, останется модным ещё долгое время. Обновление (подкрашивание) для такого варианта покраски нужно производить не чаще одного раза в два месяца, поэтому «тигровый глаз» является щадящим методом изменения внешности, не приносящим большого вреда волосам и их структуре.

Радужное окрашивание

Потрясающий эффект можно получить, применив популярное и очень презентабельное радужное окрашивание. Оно характеризуется смелыми, хотя вместе с тем плавными, интригующими переходами от одного интересного цвета к другому. Используются розовые, зелёные, синеватые и другие смелые оттенки. При отсутствии возможности сделать полноцветную радугу на волосах (например, при наличии строгих правил по дресс-коду на работе) можно сделать так называемое скрытое радужное мелирование, которое становится видно только при определённом расположении пробора. Ещё одним вариантом окрашивания в описываемом стиле является частичная покраска радужных прядей возле лица для более чёткого обрамления причёски.

Сейчас модно окрашивать волосы во все цвета радуги одновременно, поэтому не бойтесь создать столь смелый, но запоминающийся образ. Комбинировать и придумывать подходящий набор оттенков – это работа профессионального колориста нашей студии. При этом стоит помнить, что сделать радужное мелирование может любая девушка, но светловолосым проще придать все нужные оттенки. Темноволосые также могут украсить себя «радугой», просто на данную процедуру скорее всего уйдёт немного больше времени, чем на создание такого же лука для блондинки или русоволосой, так как профессиональные красящие составы проявятся в полную силу именно на природных светлых локонах.

Пастельное мелирование

Окрашивание не обязательно должно иметь яркие оттенки. Для тех, кто любит более умеренные цвета на своих локонах подойдёт пастельное окрашивание. Оно характеризуется приглушёнными, неяркими тонами, которые могут в разном порядке чередоваться на ваших кудрях. Лучше всего сделать плавный переход от корней к кончикам. В таком случае постоянно корректировать причёску не придётся, так как палитра цветов и так будет играть разноцветными мягкими бликами на волосах. При этом цвета и оттенки на основной массе волос можно менять на своё усмотрение, тем более, что пастельные оттенки (в отличие от «кричащих» тонов) будут вымываться быстрее. На пике популярности находятся окрашивания в виде градиента, начинающегося у корней с яркого тёмно-фиолетового цвета, заканчивающегося у кончиков волос на нежно-розовом оттенке.

Окрашивание, которое не отличить от натурального цвета

Вместе с явно искусственными цветами и радуги на волосах не менее модным считается покраска шевелюры в такие естественные тона, что разницу между клиенткой салона красоты и девушкой с естественно выгоревшими на солнце волосами заметить невозможно.

Если вам по душе натуральный цвет волос или надоели эксперименты с цветом шевелюры, обратитесь к опытному колористу для придания второй жизни оттенку локонов. Мастер подберёт несколько оттенков, максимально приближённых к вашему натуральному собственному цвету и буквально нарисует блики, игру света на локонах и отдельных прядках. Такая работа является максимально творческой и поэтому единой схемы для выполнения естественного окрашивания нет.

Брондирование

Брондирование является одновременно экономным способом окрашивания в более светлые оттенки, то есть осветления волос, а также данный метод считается относительно новым и модным вариантом изменения повседневного лука. В результате после бронда корни остаются тёмными, а остальная масса волос немного осветляется. Получается, что омбре очень сходно с брондированием, но всё же отличия имеются: наиболее светлый оттенок при омбре-мелировании отличается всего на пару тонов от самого тёмного в причёске, чего нельзя сказать про омбре.

Светловолосые девушки тоже могут сделать себе бронд. Это возможно только в том случае, если цвет волос натуральный. В случае искусственного осветления брондирование может иметь совершенно неожиданные результаты. Прекрасно указанный вид мелирования выглядит на пшеничного цвета локонах, а также на русых волосах.

В какой цвет краситься блондинкам, брюнеткам и рыжим?

По большому счёту вы можете выбирать практически любой цвет для изменения образа, особенно при обращении к опытному колористу. Однако лучше придерживаться определённых правил при выборе оттенка.

Какой цвет подойдёт брюнеткам?

В первую очередь девушки с тёмным цветом волос должны рассмотреть вариант покраски, называемый «тигровым глазом». Это выглядит интересно и совершенно нескучно, ведь теперь в причёске всегда будут «играть» янтарные переливы. При выборе «глаза» для окрашивания не придётся слишком сильно осветлять волосы. Такие особенные виды мелирования, как шатуш, балаяж или омбре также подойдут тёмноволосым. При этом помните:

• если нужны более светлые корни и уникальный рисунок, выбирайте балаяж;
• когда требуется небольшое естественное осветление, обратите внимание на шатуш;
• если же вам нравится градиент-цвет, красьтесь с помощью техники омбре.

Брондирование также подойдёт тем, кто не решился окрашиваться в радикальный блонд, но изменить что-то в оттенке волос хочет. Ещё вариант: горизонтальная растяжка цвета.

Блондинки и мелирование

Девушки со светлыми волосами могут рассмотреть вариант мраморного окрашивания. Оно будет прекрасно выглядеть, особенно при регулярном поддержании цвета специальным оттеночным шампунем (избавляет от нежелательной желтизны). Эффект выгоревших волос создаётся для блондинок с помощью шатуш-мелирования. Использование современного метода окрашивания, называемого бондингом, обеспечит безопасность локонов. Омбре – ещё один яркий способ для блондинок обновить и улучшить свой образ.

Какие окрашивания выбирают русоволосые девушки

Щадящее осветление в виде шатуш-мелирования рекомендуется специалистами для девушек и женщин, имеющих русый цвет волос. Такой вариант покраски будет отлично выглядеть за счёт миксования различных оттенков на локонах. Мраморное окрашивание также подходит, но очень внимательно стоит выбирать основной, то есть базовый цвет. Важно понять, какой оттенок подходит больше: холодный или тёплый.

Для русоволосых с целью придания максимальной натуральности шевелюре и её цвету предпочтительней в большинстве случаев всё-таки тёплый тон, если ваш русый не является холоднооттеночным. То же правило надо соблюдать при частичном окрашивании для того, чтобы все цвета правдоподобно выглядели при распущенных волосах. При выборе холодных оттенков, если ваш натуральный является тёплым, придётся чаще окрашивать отрастающие корни.

Виды окрашивания волос: 8 модных способов

Модные тенденции с каждым годом становятся все более совершенными. Есть много вариантов окрашивания волос, позволяющие освежить вашу прическу, полностью изменить ваш имидж или придать образу загадочности. Мелирование, брондирование, шатуш, омбре — все это техники окрашивания волос, используемые современными мастерами. Вы можете добавить прическе пикантности прикосновением другого оттенка или же выкрасить волосы целиком в совершенно новый цвет. Выбирать только вам! А мы поможем разобраться, какие виды окрашивания волос бывают, и опишем их нюансы.

1. Мелирование

Мелирование представляет собой частичное окрашивание волос. С его помощью можно сделать прическу визуально пышнее. На волосах словно появляются блики света — мастера правильно выбирают для этой цели подходящие оттенки. После процедуры пряди выглядят ухоженными, «ожившими», приобретают приятный блеск. Если вы хотите постепенно сменить темный оттенок на блонд, мелирование — именно то, что вам нужно. Это мягкий вариант перехода одного крайнего цвета в другой, без причинения вреда для структуры волос.

Эта техника имеет свои виды окрашивания как, например, калифорнийское мелирование. Темные волосы приобретают естественные, красивые переходы в более светлые тона, что особенно хорошо смотрится на рыжих, русых и темно-каштановых волосах. Отдельные пряди обесцвечиваются специальным красящим составом, причем для его высыхания не используется фольга.

2. Колорирование

Некоторые виды покраски волос могут быть схожи между собой. Например, колорирование похоже на мелирование техникой выполнения. Но при этом отдельные пряди волос окрашиваются не в один тон, а в несколько. Они могут находиться в единой цветовой гамме или же контрастировать между собой. Длительность процедуры бывает разной, в зависимости от выбранного варианта прически.

Колорирование бывает как горизонтальным, так и вертикальным. В первом случае используется три оттенка — темным прокрашивают корни, далее цвет становится более светлым, на кончиках — самый светлый. За счет таких переходов прическа будет выглядеть естественно.

А вот при вертикальном колорировании может применяться очень много оттенков — до 18 цветов. Вы можете сами их подобрать, но лучше довериться в этом вопросе мастеру, который увидит, что будет идеально смотреться именно на вашей прическе.

3. Брондирование

Лучшие современные методы окрашивания волос предлагают много интересного. Брондирование является одним из актуальных направлений, к которому прибегают достаточно часто. В ходе выполнения процедуры берется три или четыре оттенка в одной цветовой гамме. Нередко мастера делают «микс» из светлых и темных прядей, благодаря чему волосы начинают выглядеть здоровыми, естественными и красивыми. Брондирование лучше всего подходит шатенкам и брюнеткам.

4. Омбре

Различные техники окрашивания дают массу необычных эффектов. Например, омбре позволяет совершить колорирование в двух оттенках с мягким, почти незаметным переходом одного в другой. Мастер делает растяжку цвета по всей длине. Обычно кончики волос заканчиваются светлым оттенком. В классическом варианте омбре делают в каштановых или карамельных тонах. Но это не мешает представительницам молодежи выбирать необычные яркие цвета, экстравагантные оттенки.

Окрашивание в стиле омбре придает прическе желаемый объем, что особенно актуально для тех, у кого волосы достигают уровня лопаток и ниже.

5. Шатуш

Иначе такая техника окрашивания называется французским мелированием. После проведения процедуры кажется, что волосы выгорели на солнце. Подобная покраска волос подойдет как блондинкам, так и брюнеткам. Шатуш дает возможность сделать мягкие, плавные переходы оттенков, чтобы цвет был максимально естественным. Окрашивание, выполненное в этой технике, не нуждается в частой коррекции. А все потому, что корни, которые будут отрастать, не так заметны и не бросаются в глаза. Девушкам, которые не могут часто посещать салон из-за большой занятости и нехватки времени, шатуш идеально подходит.

6. Балаяж

С помощью метода можно выполнить нестандартные горизонтальные полосы в природной солнечной гамме. Даже в самом слове «балаяж» заложено ощущение элегантности, естественная утонченность и шик. На тонкие пряди наносятся прямые мазки осветляющего состава. Важно помнить, что профессионально такую технику может выполнить профессионально только мастер. Балаяж в домашних условиях сделать сложно — можно создать эффект «зебры» на волосах, что не очень красиво.

7. Мажимеш

Есть удачные техники покраски волос специально для блондинок. Мажимеш предполагает использование красок, в составе которых не аммиака, но зато есть природный воск. Идеально подходит для тех, у кого волосы пересушены, ослаблены или же слишком тонкие. Но при этом не получится получить холодный светлый оттенок, так как красящий состав не содержит в себе обесцвечивающих компонентов.

8. Тонирование

Существуют виды покрасок волос, которые не предполагают слишком глубокого проникновения краски в волос. Таким вариантом является тонирование. Это мягкая, щадящая техника для тех, кто боится испортить волосы различными химическими красящими составами. У нее есть небольшой недостаток — оттенок быстро вымывается. Зато у вас будет возможность чаще проводить эксперименты со своим образом.

Все перечисленные типы окрашивания волос выполняются намного сложнее, чем обычная покраска. Поэтому важно, чтобы их выполняли специалисты с большим опытом. Салон красоты «Hairdresser» предлагает профессиональные услуги по окрашиванию волос. Не стоит рисковать: окрашивание в домашних условиях может привести к тому, что вы испортите прическу и свое настроение. Доверьтесь нам — мы подберем для вашего образа лучшую технику, подходящие оттенки, выполним процедуру качественно и с любовью к своему делу.

Наши услуги

• Стрижка и укладка

  Стильная стрижка волос в нашем салоне позволит создать свой неповторимый образ

  Подробнее

• Окрашивание волос

  Захотелось перемен? В этом тебе поможет окрашивание волос в «Hairdresser»!

  Подробнее

• Восстановление волос

  Профессиональные процедуры комплексного восстановления и реконструкции волос

  Подробнее

• Макияж

  Услуги профессиональных визажистов и стилистов в салоне красоты «Hairdresser»

  Подробнее

• Уход за бровями

  Сделать коррекцию бровей в салоне – значит получить идеальный результат!

  Подробнее

• Уход за ресницами

  Длинные и эффектные ресницы на долго!

  Подробнее

Опубликовано в 08:19ч в Блог от HAIRDRESSER

Самые популярные виды окрашивания волос в 2020 году

29 / 07 / 20

Каждая девушка мечтает выглядеть привлекательно, ловя на себе восторженные взгляды прохожих. Для этого нужно не только подобрать подходящий образ в одежде и следить за своей физической формой, но и выбрать подходящий вариант окрашивания волос. 2020 год является отличным временем для того, чтобы внести приятные изменения в собственную внешность.

Модные техники окрашивания волос и их особенности

Перекрашивание волос считается одним из самых простых, но в то же время эффективных методов смены имиджа. В процессе проведения процедуры наши специалисты отдают предпочтение щадящим методам воздействия. Каждый клиент сможет найти именно тот вариант, который соответствует его предпочтениям благодаря внимательному отношению мастера к пожеланиям клиента.

Стилист с многолетним опытом хорошо знаком с огромным количеством техник окрашивания. Во время выбора между ними необходимо учитывать не только особенности самих волос, но и форму лица, а также другие нюансы. Некоторые техники, к примеру, омбре или балаяж довольно сложно отличить между собой. В то же время эксперту назвать конкретную технику, которая была применена в данном случае, не составит труда. Выделим несколько основных техник, которые остаются наиболее востребованными в 2020 году.

Техника окрашивания волос мелирование

Данный прием остается в моде уже много лет и в 2020 году он все также актуален. Особенностью процедуры является то, что для окрашивания используются отдельные пряди. Мелирование отличается от техники колорирования тем, что в процессе применяется всего один цвет. Обычно процедура используется девушками, которые желают осветлить волосы или придать им более яркий оттенок. Нанося краску только на часть волос, удается получить контрастный эффект. Провести мелирование в домашних условиях очень сложно. В процессе работы мастер пользуется специальной шапочкой и фольгой, на которой располагаются пряди.

Техника окрашивания волос колорирование

Многие модницы успели убедиться в том, насколько интересный эффект позволяет получить колорирование. Данный метод окрашивания волос предполагает одновременное применение нескольких оттенков, которые находятся близко друг к другу в колористике. Мастеру необходимо разделить волосы на несколько зон, после чего во время окрашивания создается эффектный переход. Техника колорирования предполагает полное или частичное окрашивание. При полном окрашивании изменяется оттенок всех прядей, а при частичном колорировании будут задействованы только отдельные участки.

Техника окрашивания волос брондирование

Данная техника окрашивания представляет собой особую разновидность колорирования. Если мастер хорошо знает свое дело, то в результате можно получить эффект выгоревших волос, который смотрится особенно привлекательно при правильно составленном образе. Данный вариант окрашивания можно рекомендовать девушкам, желающим придать своему образу изюминку, но не желающим менять его полностью. Для брондирования отлично подходят длинные или средние волосы.

Техника окрашивания волос омбре

Выбирая стрижку волос в салоне Bloom, вы всегда можете быть уверены в том, что наши специалисты внимательно выслушают все пожелания и приложат максимум усилий, чтобы вы остались довольны своим решением. Мы устанавливаем справедливые цены на услуги, которые полностью отвечают их качеству. Сделать свой стиль уникальным позволит двухцветное тонирование, которое также называют техникой омбре. В процессе работы мастеру удается создать эффект плавного перехода от одного цвета к другому. Нанося краску, специалист делает это неравномерно, распределяя ее по всей длине волос. По этой причине у корней цвет обычно оказывается более насыщенным, в то время как у кончиков он практически переходит в блонд.

Техника окрашивания волос шатуш

Если девушка больше предпочитает естественный эффект, то ее выбором должна стать техника шатуш. Данный способ окрашивания можно сравнить с техникой омбре, которая не касается корней, но обеспечит естественную имитацию выгорания волос. Шатуш интересна тем, что позволяет получить более хаотичный результат. Во время нанесения краски цвет буквально растягивается, поэтому лучше всего применять этот способ окрашивания на длинных волосах, чтобы продемонстрировать глубину перехода.

Техника окрашивания волос мажимеш

Еще одной техникой, которую можно смело использовать в 2020 году, является мажимеш. Она заключается в том, чтобы осветлить светлые волосы. Техника позволяет придать волосам цвет на несколько оттенков светлее, если сравнивать с первоначальным. Данный красящий состав отличается:

• хорошей стойкостью;
• укрепляющими компонентами;
• отсутствием опасных добавок.

В результате удается не только придать волосам желаемый цвет, но и укрепить их структуру, что особенно важно для обладательниц ломких волос.

Техника окрашивания волос балаяж

В рамках данной техники происходит градуированное окрашивание, которое не касается корней. Красящий состав наносят только на кончики и середину локонов. Результатом такого окрашивания станет легкое изменение оттенка, которое особенно эффектно выглядит на завитушках.

Техника окрашивания волос тонирование

Говоря о щадящих методах окрашивания, многие мастера сразу же вспоминают тонирование. Для подобной процедуры применяется безаммиачная краска, которая бережно воздействует на структуру волос. Оттенок же изменяется незначительно, что позволяет сохранить натуральный пигмент волос. В рамках техники можно изменить цвет волос всего на пару тонов, что нужно учитывать.

Техника однотонное окрашивание волос

Данный прием можно отнести к наиболее простым. Для нанесения краски используются более мощные препараты, поэтому цвет оказывается ярче, а также приобретает требуемую стойкость. Мастер в нашем салоне всегда поможет выбрать оттенок, который идеально подойдет именно вам, в то время как в домашних условиях всегда можно ошибиться с выбором.

Техника окрашивания волос аиртач

Как следует из названия данной техники, при правильном окрашивании волосы выглядят воздушными, что позволяет придать изюминку и оживить ваш образ. Техника особенно актуальна среди обладательниц светлых волос, которые желают получить несколько белых прядей. Также ее можно рекомендовать брюнеткам, которые хотят поэкспериментировать со светлыми волосами, но не желают наносить ущерб своим локонам.

Чтобы сохранять волосы здоровыми и привлекательными, рекомендуем использовать качественный домашний уход. Интернет-магазин косметики BLOOM предлагает высококачественную косметику по уходу за волосами.

модные техники окрашивания волос, тенденции / Блог / Школа Шопинга

Я получаю от вас очень много вопросов про уход за волосами, лицом и телом.

И я абсолютно уверена, что ответы на эти вопросы нужно получать не от обывателей (как я), а от профессионалов.

Те, кто подписаны на меня давно, знают, что мои волосы я уже несколько лет доверяю только  Z Flat. Ребята уже написали для вас в блоге ШШ одну мегаполезную статью про мифы салонной индустрии, чтобы вы выбирали только полезные и безопасные процедуры для волос и не становились жертвами маркетинговых и рекламных кампаний.

Сегодня команда Z_Flat расскажет про модные техники окрашивания волос и покажет, как они выглядят.

 Но перед тем, как мы перейдем к ним, я быстренько отвечу на участившиеся вопросы про выпадение волос.

Я не врач, конечно!

⠀

Но пользуясь возможностью, хочу всем девочкам напомнить, что причина, как правило, ВНУТРИ.

⠀

Летом, пока мы жили в Лос Анджелесе, у меня жутко выпадали волосы, поэтому между поездками я срочно навестила трихолога, к которому для скорости и в связи с вечным цейтнотом пришла сразу с анализами:

⠀

• щитовидка: ттг, т4 свободный, т3 свободный, атТПО
• железо, я сдаю всегда развернутый профиль, т.к. с анемией знакома более чем близко: гемоглобин, сывороточное железо, ферритин
• женские гормоны на 2-5 день цикла: ЛГ, ФСГ, пролактин, тестостерон, кортизол, эстрадиол, ДГАS, 17OH-прогестерон,
• витамин D
• общий анализ крови ⠀

⠀

Обычно, сильное выпадение волос продолжительностью ДО 3 месяцев могут считать нормой, свыше — нужно бить тревогу.

⠀

Я забила тревогу быстро, но волос все равно выпало очень много.  Половина — без преувеличения. Мне назначили уход и лечение.

⠀

На третий месяц выпадение остановилось, сейчас вся голова в «антенках» из коротких волосков, к счастью, они шустренько растут.

⠀

Я верю в сон (грешна, верю, но не сплю, сколько надо), нормальное питание, хотя бы минимальный спорт и мезо-терапию кожи головы. И только потом всякие шампуни, втирки и маски, подобранные профессионалами, а не купленные наугад в продуктовом магазине.

⠀

Если вы ощущаете, что с волосами проблема — берегите время и нервы, идите к трихологу как минимум.

 

И вообще, помимо выпадения волос есть 1000 причин раз в полгода-год сдавать анализы и делать УЗИ молочных желез и навещать гинеколога. Так что, если вы ждали знак — это он.

Заботьтесь о себе, девочки! И не откладывайте это в долгий ящик — сами знаете, что выпадение волос далеко не самое серьезное последствие несерьезного отношения к женскому здоровью. 

 

А теперь разберемся с тем, как именно должно выглядеть стильное и современное окрашивание.

Команда Z_Flat рассказывает и показывает, какие виды окрашивания волос существуют, какие техники сейчас в тренде, а с какими стоит быть осторожнее. 

МОДНЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ ВОЛОС

ОКРАШИВАНИЕ В ОДИН ТОН

Классическое окрашивание или тонирование волос. Классика всегда в моде. С одеждой это, правда, не работает, а вот с окрашиванием – пожалуйста! Тут ошибиться сложно. 

Но тут стоит помнить, что окрашивание в один тон и тонирование — это все-таки диаметрально разные процедуры 🙂

Их главные отличия:

• Тонирование НЕ ВСЕГДА может закрасить седину
• Перманентным красителем (окрашивание) по ранее неокрашенным волосам можно сделать цвет на тон-два светлее. Тонирование — это либо ваш же цвет, либо на тон темнее.
• Как правило, тонирование смывается гораздо быстрее окрашивания.

В окрашивании ещё есть нюансы. Особенно с тёмными оттенками. Наверняка многие сталкивались с ситуацией, когда красишься в один и тот же цвет, а спустя некоторое время волосы становятся… чёррррненькими.

А всё дело в том, что пигмент из любой краски не смывается полностью и имеет свойство накапливаться в волосах (даже когда кажется, что все смылось). Наслаиваясь друг на друга, молекулы цвета постепенно уплотняются и дают тот самый нежелательный эффект.

Кстати, если красить по одной и той же формуле от корней до кончиков каждый раз, в определённый момент после сушки вы увидите корни светлее основной длины. Причины те же 🙂

Что делать? Найти мастера, который разбирается в предмете и бежать от тех, кто предлагает вам выбрать цвет в палитре, а потом его же и использует.

 

БЛОНДИРОВАНИЕ

Эта техника предполагает ровный, без переходов и бликов по всей длине волос цвет, выбранного светлого тона. Но получить красивый блонд вы сможете только у квалифицированного колориста, который выполнит работу правильно, учитывая все нюансы. А нюансов там действительно очень много. 

Я категорически не рекомендую экспериментировать дома, потому что, как правило, результат не оправдывает ожидания. А чтобы исправить это, придется потрудиться. 

Да, экстра-светлые блонды действительно требуют много времени, сил и денег – это аксиома!  Но даже при выполнении всех этих условий, стоит помнить главное!

Сохранить качество цвета и волос на достойном уровне получится, если родной цвет по насыщенности от 7 тона и выше. Остальные случаи – скорее исключение, чем правило. Превратиться из жгучей натуральной восточной брюнетки в златовласую Рапунцель – что-то из области городских легенд. 

не надо так:(

СЛОЖНЫЕ ОКРАШИВАНИЯ  

Мелирования, омбре, балаяжи, шатуши и прочие модные словечки, словарь из которых ежегодно пополняется, относятся к сложным окрашиваниям. Но на самом деле, все эти названия обычному человеку запоминать не обязательно. Ведь все они касаются исключительно техники и рисунка нанесения продукта, а по эффекту плюс-минус похожи. 

МЕЛИРОВАНИЕ 

Первопроходец среди сложных окрашиваний на российском бьюти-рынке. 

Мелирование можно выполнить как осветляющим порошком, так и краской. Главное – выбрать профессионального колориста. Он вам и волосы сохранит в хорошем состоянии, и краску нужную подберет.

Особенно хочу подчеркнуть, что мелирование — это основа. Следовательно после процедуры волосы обязательно нужно тонировать!

В противном случае результат не будет красивым и это, мягко говоря, уже давно не модно и просто неприлично. 

К сожалению, мелирование без последующего тонирования всё ещё встречается и довольно часто. Объясняю, почему это не хорошо. В первую очередь, итог мелирования – это «вытравленные» осветляющим порошком волосы. А это значит, что волос остался без пигмента, стал пористым, ломким, неэластичным. Вид таких волос без укладки получается крайне неопрятным.

Во-вторых, конечно, цвет прядей: от золотисто-желтого до пепельно-белого. Оттенки первого не всем нравятся и подходят, а второй может прибавить вам лет 5-10, т.к. даст эффект седины. 

Поэтому обязательно после мелирования нужно затонировать волосы безаммиачными красителями! Переходы цвета получатся мягкими, что дает ощущение бОльшего объёма и натуральности. 

Тонирование закроет чешуйки осветлённого волоса и сделает его снова гладким. Поэтому причёска на затонированных волосах всегда будет выглядеть ухоженной, а волосы – здоровыми. 

ШАТУШ, ОМБРЕ, БАЛАЯЖ и прочие

Как и я написала выше, эффект у сложных окрашиваний похож. Основная задумка шатуш, омбре и балаяж (хотя последнее — это вообще название техники нанесения краски, но опять же, углубляться в теорию колористики всем не нужно) – это глубокие корни и рассветление к концам. 

Дают ощущение объема, густоты волос. Близкие друг к другу тона создают эффект, при котором волосы становятся единой объемной копной. Получается очень красивая имитация выгоревших прядей.

Тут не должно быть никаких резких контрастов, только плавные переходы между оттенками. 

ОКРАШИВАНИЕ AIR TOUCH

AIR TOUCH – относительно новая техника окрашивания. По одной из легенд – придумана российским колористом. Эффект – всё тот же. Постепенный переход от тёмного к светлому. Но техника нанесения не совсем обычная. 

При окрашивании пряди выдуваются феном. Все пушковые волоски выдуваются и не задействуются, а длинные осветляются. А так как у всех количество этих самых пушковых волос разное, то и выдуваются они у всех по-разному. Получается индивидуальная история. Окрашивание, не похожее ни на чьё другое. Смотрится очень мягко, мелко и деликатно. Но поскольку работа более кропотливая, то и стоимость выше, в отличие от предыдущих техник. 

И напоследок хочу ещё раз призвать вас НЕ заучивать всевозможные названия окрашиваний. Они столь же бесполезны, как и название цветов волос в бумажных каталогах-палитрах. Лучше найдите колориста с золотыми руками (и мозгами). Я таких уже нашла, чего и вам искренне желаю. 

Вот, кстати, их ответ по поводу «калифорнийских мелирований» и прочих страстей. Заскриньте и читайте как мантру, перед походом в салон 🙂

И, девочки, помните, что как бы красиво не выглядело окрашивание на картинке на чужой голове, это совсем не значит, что именно этот оттенок станет правильным для вас. А волосы у нас – одни. Они, конечно, снова отрастут. А, может быть, вам удастся безболезненно исправить неудачное окрашивание. 

Но в большинстве случаев, неподходящие окрашивания приносят много огорчений, расходов на восстановление и лечение волос и т.д.

Поэтому прежде чем экспериментировать наугад, узнайте, какие варианты окрашивания вам действительно подходят. Сделать это и многое другое можно в онлайн-школе — прямо сейчас идет ранняя регистрация со скидкой 10 000р. на курс, который окупится после первого же шопинга и визита к колористу и будет работать на вас всю жизнь:-)

Современные техники окрашивания волос. — aleks-school

Окрашивание волос – один из беспроигрышных способов создания нового образа. Такое решение позволит выглядеть более свежо и стильно. Кроме того, данная процедура необходима тем, кто имеет невыразительный натуральный цвет волос или же просто хочет поэкспериментировать.

На данный момент используется ряд современных техник, которые позволяют минимизировать вред процедуры и сохранить здоровые волосы. В этом году есть несколько основных трендов окрашивания, которые помогут выглядеть стильно.

Стоит отметить, что сейчас в моде сочетание нескольких оттенков, а также создание их плавных переходов. Такие решения – интересная альтернатива классическому однотонному окрашиванию. Девушкам предлагается огромный выбор техник, с помощью которых можно с легкостью создать неповторимый образ.

Главное в этом вопросе – найти хорошего мастера, который не только поможет подобрать оптимальный вариант, но и выполнит процедуру максимально качественно.

Основные модные техники

В этом году особенно модным считается создание контраста за счет сочетания более светлых и более темных прядей. К основным техникам окрашивания можно отнести:

1. Балаяж. Такой способ позволяет создать эффект выгоревших прядей – в результате получается очень естественная прическа. Для этого создаются переходы более светлых и темных оттенков. Тона подбираются в зависимости от цвета волос. При этом такие переходы не имеют заметной границы и отличаются плавностью.
2. Скандинавский поинт. Данная техника является разновидностью блондирования и подразумевает создание плавного перехода холодных светлых оттенков на макушке к теплым на кончиках.
3. Мелирование. Сама по себе эта техника давно вышла из моды и даже считается проявлением плохого вкуса. Однако современные способы мелирования подразумевают последующее тонирование, которое позволяет создавать стильные оттенки волос. В этом году особенно модными считаются пудровые, голубые цвета. При этом внешний вид получается более мягким и естественным.
4. Омбре. Считается одним из наиболее модных трендов – в этом случае создается плавный переход темного цвета шевелюры к светлому или же наоборот. Такое решение одинаково хорошо подходит как блондинкам, так и брюнеткам. При окрашивании используется множество оттенков одного цвета, которые сочетаются по принципу градации.

Помимо этого, можно выделить технику колорирования, которая также актуальна в этом сезоне. В данном случае используется хаотичное сочетание прядей различных оттенков. Причем цвет может быть как максимально естественным, так и ярким.

Эффекты современных техник окрашивания

Окрашивание – процедура, к которой прибегают не только для смены имиджа или создания нового образа. С его помощью также можно успешно скрыть ряд недостатков. Дело в том, что главной особенностью современных техник является тщательная прокраска каждой пряди, для которой выбирается собственный оттенок. По этой причине в результате получается цвет с множеством плавных переходов. Данную особенность можно использовать для создания таких эффектов:

1. Увеличение объема. Использование переливов из различных оттенков поможет сделать волосы зрительно более густыми. Для выполнения такой задачи отлично подходит мраморное окрашивание, а также балаяж.
2. Подчеркивание длины. Зрительно «вытянуть» прическу поможет скандинавский поинт или шатуш. Последняя техника подразумевает покраску с сохранением натурального цвета на макушке (как правило, выбирается более светлая палитра).
3. Создание «эффекта укладки». Чтобы волосы выглядели более ухоженными, стоит выбрать технику с сочетанием несколько оттенков одного цвета. В данном случае хорошим решением станет колорирование.

Таким образом, выбор правильного варианта поможет сформировать продуманный образ, привлекающий взгляды!

Основные правила выбора техники

При выборе способа окрашивания стоит учитывать цвет глаз и кожи. Так, все техники блондирования не подходят кареглазым девушкам со светлой кожей. В таком случае оптимальным решением станет эффект омбре, балаяж или шатуш, в которых используются карамельные, шоколадные оттенки.

Обладательницам голубых глаз стоит использовать еще одну модную в этом сезоне технику – мелирование с созданием пепельного оттенка. Такое решение особенно смотрится особенно эффектно на коротких или волнистых шевелюрах. Отличным вариантом в этом случае станет любой из способов блондирования – от скандинавского поинта до хаотичного распределения более светлых и более темных прядей.

новая технология окрашивания или хорошо забытое старое?

В моде естественность и сложные переходы. Отходят на второй план алюминиевые блонды, контрастное мелирование прядями и окрашивания в один тон. Сейчас популярны мягкие переливы цвета на волосах, придающие визуальный объем и значительно продлевающие время между окрашиваниями. Добиться этого эффекта поможет технология AirTouch.

Технология AirTouch

«Прикосновение воздуха» — так дословно переводится название технологии окрашивания. Этот метод сочетает в себе давно завоевавшую прочные позиции технику мелирования и стремление отвечать духу времени. Волосы перед обработкой разделяют на пряди, а затем обдувают струей воздуха из фена, так, чтобы от каждой из прядок осталось примерно 30-50% первоначального объема. Аналогичного эффекта можно добиться различными способами, в том числе зигзагообразным выдерением прядей, которые будут прокрашены и тщательной растушевкой границ. Затем каждую из прядей заворачивают в фольгу или прозрачную пленку, либо просто подкладывают хлопковый валик под основание пряди, чтобы избежать смешивания.

Краску, как и в обычном мелировании, наносят с отступом от корней, максимально размывая линию перехода сухой(!) кистью, что позволяет добиться эффекта бликов в волосах. Именно в умении создать на волосах красивый рисунок в полной мере проявляется профессионализм стилиста.

Эффект «омбре» и AirTouch

Для еще более естественного эффекта «слегка отросших волос» и продления времени между окрашиваниями, применяют технологию «омбре», то есть прикорневую зону затемняют. При этом линии переходов стараются делать максимально размытыми: никаких полос, никаких контрастов. С помощью техники можно достичь разных результатов: как естественного эффекта выгоревших на солнце волос, так и нежных цветных оттенков, придающих облику юный и отдохнувший вид. В этом сезоне модными остаются пастельные мятные, сиреневые, розоватые оттенки. Современные красители позволяют добиться этого даже без предварительного обесцвечивания, сохраняя здоровый блеск и плотность волос. Однако, в случае с AirTouch волосы тонируются, в том числе, в парикмахерской мойке уже после основного этапа.

Техника AirTouch и ее преимущества:

• Это щадящая техника окрашивания, при которой обрабатывается не вся масса волос, а только некоторые пряди. При этом самые тонкие, мягкие и короткие волосы выдуваются струей воздуха из фена
• Это способ добавить в образ освежающий, но не кричащий нюанс, который будет уместен в любой обстановке
• Отрастающие корни при окрашивании с помощью этой технологии выглядят естественно и уместно

Попробуйте обновленный образ в Empathystudio!

Поделиться «AirTouch — новая технология окрашивания или хорошо забытое старое?»

Обзор популярных видов окрашивания волос

Хочу рассказать об основных видах и популярных направлениях в окрашивании. Этот список может быть бесконечным, я решила охватить самые востребованные и дать краткую характеристику каждому из них.

Airtouch

Airtouch – это cамая запрашиваемая техника на данный период времени. И не зря. Ее востребованность в том, что:

• носится долго (от 3 месяцев до года)
• имеет самые мягкие, плавные переходы цвета (среди всех существующих на данный момент техник осветления)
• не зависит от вида и формы стрижки (например, техника балаяж лучше всего смотрится на каскадных стрижках)
• подходит для любого цвета волос (светлого, темного, рыжего, русого и т.д.).

Сочетание всех этих качеств говорит-само за себя. Окрашивание airtouch уже вошло в историю колористики и еще не раз найдет свое новое прочтение, обрастая новыми нюансами и хитростями.

Мелирование

Уже не новый, но не утративший актуальности вид окрашивания.

Технично выполненное мелирование визуально делает общий тон волос светлее, при этом четких границ между «своим» цветом и осветленными прядями быть не должно.

Мелирование выполняется на всю массу волос или на отдельную зону (например, только на теменную), работает в комбинации с другими техниками. Не является самостоятельным видом окрашивания. После мелирования требуется выполнить процедуру тонирования. Иначе рискуете здоровьем и красотой волос. Мелирование очень хорошо маскирует небольшую седину.

Babylights

Babylights – это “деликатная” разновидность мелирования. В работе задействуется только одна треть волос, в основном, та, что обрамляет лицо.

Пряди осветляются по специальной схеме, так чтобы казалось, что они сами выгорели на солнце, как это бывает у маленьких детей (отсюда и название от англ. «вaby»-малыш, «light»-светлый).

После осветления подбирается оттенок тонирования, таким образом, чтобы осветленные пряди отличались контрастностью от общего цвета только на два тона. Тогда окрашивание будет смотреться гармонично. Его главное отличие от классической техники мелирования: babylights расставляет акценты, уровень глубины тона волос остается прежним, натуральным.

3D окрашивание

Техник окрашивания 3D множество, но принцип один. За основу берется один тон (выигрышнее всего это окрашивание смотрится на блондинках), к нему подбираются еще два выразительных, но не контрастных оттенка: на тон светлее и на тон темнее. Результат окрашивания дает «объемный» цвет и многогранные переливы. Советую попробовать этот вид окрашивания тем, кому наскучил однотонный блонд, но еще не готов к кардинальным переменам.

Мраморное окрашивание

Относится к видам мультитональных (несколько цветов) окрашиваний. Мраморное окрашивание представляет собой одну из техник мелирования, в которой чередуются светлые и темные пряди. Получившийся результат напоминает мраморный камень. Подходит обладательницам уровня глубины тона от 6 (темно русый) и выше. Я считаю: этот вид окрашивания уже устарел и почти вышел из использования, из-за яркой контрастности переходов между цветами, что не соответствует течению современных трендов.

Окрашивание «тигровый глаз»

Окрашивание «тигровый глаз» получило свое название от визуального эффекта, которое оно производит. Его отличительной чертой является гамма оттенков, использующихся в окрашивании. Это цвета теплой палитры: карамельный, каштановый, коньячный, медный, золотистый и т.д. Техники, применяемые для этого окрашивания, могут быть самыми разными: от мелирования до балаяжа. Главное – комбинация теплых оттенков, напоминающих окрас тигра.

Блочное окрашивание

Блочное окрашивание всегда будет популярно среди подростковой аудитории, ценящей самовыражение и яркие акценты. Его легко выполнить дома, подобрав правильный краситель. Для окрашивания выбираются отдельные пряди или зоны. Остальная масса волос может не участвовать в процессе.  Особенно эффектно оно смотрится в необычной стрижке с асимметричными элементами. Подходит для получения блоков модных в окрашивании оттенков серого, пепельного, клубничного и др.

Скрытое окрашивание

Скрытое окрашивание является подвидом блочного окрашивания. Его отличие – место расположения окрашенных волос – височная, затылочная и нижнезатылочная зоны. Этот вид окрашивания выбирают из-за своей особенности дети школьного возраста и те, кому яркие и явные эксперименты противопоказаны (дресс-код, и т.д.). Выполняется разными видами красителей, в зависимости от пожеланий и исходного цвета волос. Подробнее о детском окрашивании волос на этой странице.

https://www.instagram.com/p/Bb1ur-JnP_5/

Пиксельное окрашивание

Пиксельное окрашивание уже не новый тренд в колористике, в этом году он возвращается к нам в модных пастельных тонах. Его «фишка» в уникальности рисунка и бесконечности вариаций использования цвета. Краситель наносится локально, с помощью специально разлинованных планшетов. Таким образом получается объемный трехмерный рисунок, состоящий из цветных квадратиков (как в игре тетрис). Находиться такой рисунок может на любой зоне головы и даже быть скрытым.

https://www.instagram.com/p/BghJT43lqhL/

Dim out

Еще этот вид окрашивания может встречаться под названиями: «rooty blond» или «nirvana blond». Означает затемнение корней (чаще всего у блондинок) в цвет близкий натуральному. Этот «ленивый» тренд в окрашивании возник не так давно, но распространился сразу. За счет своей носибельности и корректирующих свойств. Круглолицая Селена Гомез выбрала именно этот способ для перехода в блонд. Темные натуральные корни визуально сужают обьемы лица, приближая к идеальной форме-овалу.

Но не стоит путать этот вид окрашивания с просто отросшими корнями.

Все немного сложнее. Отросшие корни имеют четкую границу с осветленной длинной, а в окрашивание dim out этот контраст размыт.

Ombre

Окрашивание омбрэ относится к техникам «свободной руки». Мастер работает осветляющим порошком, распределяя его от концов к середине длины волос. В результате получается градиентное горизонтальное осветление, переходящее в основной цвет.

Такая техника подходит и для коротких волос. Смотрите, как смотрится окрашивание омбре на каре.

После, волосы тонируются для того, чтобы получить плавный переход и красивый оттенок. Цвет тонировки может быть разным и не обязательно «натуральным». Например, сейчас в моде бирюзовые и голубые оттенки.

Balayage

Еще одна техника «свободной руки», отличается от омбрэ расположением светлых прядей (вертикальное) и менее контрастным переходом. Очень похоже на окрашивание шатуш, но наиболее ярко выраженное. В балаяже осветленные пряди, чередующиеся с основным тоном, могут начинаться от корней, плавно переходя в длину.

Shatush

Тоже относится к техникам «свободной руки». При окрашивании шатуш рисунок светлых прядей вертикальный, как и в технике балаяж, но линии окрашивания мягкие, растушеванные. Волосы выглядят естественно, как выгоревшие на солнце.

Ниже представлена таблица для сравнения разных видов техники “свободной руки”

Техника окрашивания Blur

Эта техника разработана компанией Redken. Получила свое названия от фильтра, использующегося для коррекции фото.

«Blur»- от англ. размытый.

Окрашивание в технике blur представляет собой вид тонирования, состоящий из двух оттенков, плавно перетекающих друг в друга. Наносится тонирование на уже существующую осветленную базу (это окрашивание подойдет только блондинкам), в специально разработанной технике. Оттенки, для окрашивания подбираются не яркие – пыльные, размытые, пастельные.

Методы окрашивания

Поскольку микробная цитоплазма обычно прозрачна, необходимо окрашивать микроорганизмы, прежде чем они будут видны в световой микроскоп. В некоторых случаях окрашивание не требуется, например, когда микроорганизмы очень большие или когда необходимо изучить подвижность, и каплю микроорганизмов можно поместить непосредственно на предметное стекло и наблюдать. Такая подготовка называется мокрым креплением . Влажную основу также можно приготовить, поместив каплю культуры на покровное стекло (стеклянную крышку для предметного стекла), а затем перевернув ее над полым предметным стеклом.Эта процедура называется «висящей каплей ».

При подготовке к окрашиванию небольшой образец микроорганизмов помещается на предметное стекло и сушится на воздухе. Мазок фиксируется нагреванием, быстро проводя его над пламенем. Термофиксация убивает микроорганизмы, заставляет их прилипать к предметному стеклу и позволяет им принять пятно.

Простые методы окрашивания. Окрашивание может выполняться с помощью основных красителей, таких как кристаллический фиолетовый или метиленовый синий, положительно заряженные красители, которые притягиваются к отрицательно заряженным материалам микробной цитоплазмы.Такая процедура представляет собой простую процедуру окрашивания . Альтернативой является использование красителя, такого как нигрозин или конго красный, кислых, отрицательно заряженных красителей. Они отталкиваются отрицательно заряженной цитоплазмой и собираются вокруг клеток, оставляя клетки прозрачными и неокрашенными. Этот метод называется методом отрицательного окрашивания .

Дифференциальные методы окрашивания. Методика дифференциального окрашивания различает два вида организмов. Примером может служить метод окраски по Граму . Этот дифференциальный метод разделяет бактерии на две группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Сначала наносится кристаллический фиолетовый, а затем протравный йод, фиксирующий пятно (рисунок). Затем предметное стекло промывают спиртом, и грамположительные бактерии сохраняют кристально-фиолетовую окраску йода; однако грамотрицательные бактерии теряют окраску. Впоследствии грамотрицательные бактерии окрашиваются сафраниновым красителем, контрастирующим красителем, используемым следующим. Эти бактерии выглядят красными под масляной иммерсией, в то время как грамположительные бактерии выглядят синими или пурпурными, что отражает кристаллический фиолетовый цвет, оставшийся на этапе промывки.

Другой метод дифференциального окрашивания — это кислотостойкий метод . Этот метод отличает виды Mycobacterium от других бактерий. Для переноса первого красителя, карболфуксина, в клетки используется тепло или липидный растворитель. Затем клетки промывают разбавленным кислотно-спиртовым раствором. Виды Mycobacterium сопротивляются действию кислоты и спирта и сохраняют окраску карболфуксина (ярко-красный). Другие бактерии теряют пятно и приобретают последующее окрашивание метиленовым синим (синим).Таким образом, кислотоустойчивые бактерии выглядят ярко-красными, в то время как некислотные бактерии выглядят синими при наблюдении под иммерсионной микроскопией в масле.

Другие методы окрашивания направлены на выявление различных важных бактериальных структур. Например, специальная техника окрашивания выделяет жгутиков бактерий, покрывая жгутики красителями или металлами для увеличения их ширины. Затем можно наблюдать окрашенные таким образом жгутики.

Для исследования спор бактерий используется специальный метод окрашивания. Малахитовый зеленый используется при нагревании, чтобы заставить пятно проникнуть в клетки и придать им цвет. Затем используется контрастное краситель, сафранин, чтобы придать цвет неспорообразующим бактериям. В конце процедуры споры окрашиваются в зеленый цвет, а другие клетки окрашиваются в красный цвет.

Процедура окрашивания по Граму для разделения бактерий на две группы .

Другой метод дифференциального окрашивания — это кислотостойкий метод . Этот метод отличает виды Mycobacterium от других бактерий.Для переноса первого красителя, карболфуксина, в клетки используется тепло или липидный растворитель. Затем клетки промывают разбавленным кислотно-спиртовым раствором. Виды Mycobacterium сопротивляются действию спиртовой кислоты и сохраняют окраску карболфуксина (ярко-красный). Другие бактерии теряют пятно и приобретают последующее окрашивание метиленовым синим (синим). Таким образом, кислотоустойчивые бактерии выглядят ярко-красными, в то время как некислотные бактерии выглядят синими при наблюдении под иммерсионной микроскопией в масле.

Другие методы окрашивания направлены на выявление различных важных бактериальных структур.Например, специальная техника окрашивания выделяет жгутиков бактерий, покрывая жгутики красителями или металлами для увеличения их ширины. Затем можно наблюдать окрашенные таким образом жгутики.

Для исследования спор бактерий используется специальный метод окрашивания. Малахитовый зеленый используется при нагревании, чтобы заставить пятно проникнуть в клетки и придать им цвет. Затем используется контрастное краситель, сафранин, чтобы придать цвет неспорообразующим бактериям. В конце процедуры споры окрашиваются в зеленый цвет, а другие клетки окрашиваются в красный цвет.

Дифференциальные методы окрашивания — Микробиология: лабораторный опыт

Просмотр бактериальных клеток

Микроскоп — очень важный инструмент в микробиологии, но есть ограничения, когда дело доходит до его использования для наблюдения за клетками в целом и бактериальными клетками в частности. Двумя наиболее важными проблемами являются разрешение и контраст. Разрешение — это ограничение, с которым мы ничего не можем поделать, поскольку большинство бактериальных клеток уже близки к пределу разрешения большинства световых микроскопов.Однако контраст можно улучшить либо с помощью оптической системы другого типа, такой как фазовый контраст или микроскоп для дифференциального интерференционного контраста, либо путем окрашивания клеток (или фона) хромогенным красителем, который не только добавляет контраст, но и дает им тоже цвет.

В микробиологии используется множество различных красителей и процедур окрашивания. Некоторые включают одно пятно и всего несколько шагов, в то время как другие используют несколько пятен и более сложную процедуру. Прежде чем вы сможете начать процедуру окрашивания, клетки должны быть закреплены (размазаны) и зафиксированы на предметном стекле.

Бактериальный мазок — это просто небольшое количество культуры, растекающееся в виде очень тонкой пленки на поверхности предметного стекла. Чтобы предотвратить вымывание бактерий во время этапов окрашивания, мазок может быть химически или физически «прикреплен» к поверхности предметного стекла. Тепловая фиксация — это простой и эффективный метод, который достигается путем кратковременного пропускания предметного стекла через пламя горелки Бунзена, в результате чего биологический материал становится более или менее прочно прикрепленным к поверхности стекла.

Термофиксированные мазки готовы к окрашиванию. При простом окрашивании в мазок добавляются красители, которые либо притягиваются зарядом (катионный краситель, такой как метиленовый синий или кристаллический фиолетовый), либо отталкиваются зарядом (анионный краситель, такой как эозин или тушь). Катионные красители связывают бактериальные клетки, что хорошо видно на ярком фоне. Анионные красители отталкиваются клетками, поэтому клетки становятся яркими на окрашенном фоне. Примеры того и другого см. На рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Отрицательное окрашивание Cyptococcus neoformans , инкапсулированных дрожжей.
Рисунок 2. Положительное окрашивание Staphylococcus aureus.

Вероятно, наиболее важной особенностью, которая становится очевидной при окрашивании бактериальных клеток, является их клеточная морфология (не путать с морфологией колоний, которая представляет собой появление бактериальных колоний на чашке с агаром). Большинство гетеротрофных и культивируемых бактерий имеют несколько основных форм: сферические клетки (кокки / кокки), палочковидные клетки (палочки / бациллы) или палочковидные клетки с изгибами или изгибами (вибрионы и спириллы соответственно).Существует большее разнообразие форм среди архей и других бактерий, встречающихся в экосистемах, отличных от человеческого тела.

Часто бактерии создают особые расположения клеток, которые образуются в результате бинарного деления бактериями в процессе их размножения. Договоренности особенно очевидны с неподвижными бактериями, потому что клетки имеют тенденцию оставаться вместе после завершения процесса деления. И форма, и расположение клеток являются характеристиками, которые можно использовать для различения бактерий.Наиболее часто встречающиеся формы бактерий (кокки и бациллы) и их возможное расположение показаны на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3. Возможное расположение бактериальных клеток для кокков.

Рисунок 4. Возможное расположение бактериальных клеток для бацилл.

Дифференциальные методы окрашивания

В микробиологии методы дифференциального окрашивания используются чаще, чем простые окрашивания, как средство сбора информации о бактериях. Методы дифференциального окрашивания, которые обычно требуют более одного окрашивания и нескольких этапов, называются таковыми, потому что они позволяют дифференцировать типы клеток или клеточные структуры.Самым важным из них является окраска по Граму. Другие методы дифференциального окрашивания включают окрашивание эндоспор (для идентификации эндоспорообразующих бактерий), кислотостойкое окрашивание (для отличия видов Mycobacterium от других бактерий), метахроматическое окрашивание для идентификации гранул, накапливающих фосфат, и окрашивание капсул (для идентификации инкапсулированные бактерии). Мы будем выполнять процедуры окрашивания по Граму и эндоспор в лаборатории и просматривать подготовленные слайды, которые выделяют некоторые другие клеточные структуры, присутствующие в некоторых бактериях.

Пятно по грамму

Рисунок 5. Бактерии, окрашенные по Граму.

В 1884 году врач Ганс Кристиан Грам изучал этиологию (причину) респираторных заболеваний, таких как пневмония. Он разработал процедуру окрашивания, которая позволила ему идентифицировать бактерии в легочной ткани, взятой у умерших пациентов, как этиологический агент фатальной пневмонии. Хотя метод окрашивания по Граму мало помог в лечении болезни, он значительно упростил диагностику причины смерти человека при вскрытии.Сегодня мы используем методы окрашивания по Граму, чтобы помочь в идентификации бактерий, начиная с предварительной классификации на одну из двух групп: грамположительных или грамотрицательных .

Дифференциальный характер окраски по Граму основан на способности некоторых бактериальных клеток сохранять первичное окрашивание (кристаллический фиолетовый), сопротивляясь процессу обесцвечивания. Окрашивание по Граму включает четыре этапа. Сначала клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым с последующим добавлением фиксирующего агента для окрашивания (йода).Затем применяется спирт, который выборочно удаляет пятно только с грамотрицательных клеток. Наконец, добавляется вторичный краситель, сафранин, который окрашивает обесцвеченные клетки в розовый цвет.

Хотя в то время Грам не знал этого, основное различие между этими двумя типами бактериальных клеток — это их клеточные стенки. Стенки грамотрицательных клеток имеют внешнюю мембрану (также называемую оболочкой), которая растворяется во время мытья спиртом. Это позволяет красителю кристаллического фиолетового ускользнуть. Только обесцвеченные клетки поглощают розовый краситель сафранин, что объясняет разницу в цвете между двумя типами клеток.По завершении процедуры окрашивания по Граму грамположительные клетки выглядят пурпурными, а грамотрицательные — розовыми.

При интерпретации мазка, окрашенного по Граму, необходимо также описать морфологию (форму) клеток и их расположение. На рисунке 5 представлены два различных типа бактерий, которые можно различить по реакции окрашивания по Граму, а также по их форме и расположению. Ниже опишите эти характеристики для обеих бактерий:

Кислотостойкое окрашивание

Некоторые бактерии производят воскообразное вещество миколик кислоту , когда они строят свои клеточные стенки.Миколиновая кислота действует как барьер, защищающий клетки от дегидратации, а также от фагоцитоза клетками иммунной системы хозяина. Этот восковой барьер также предотвращает проникновение пятен в клетку, поэтому окраска по Граму не работает с микобактериями, такими как Mycobacterium , которые являются патогенами людей и животных. Для этих бактерий используется метод окрашивания acid — fast .

Рисунок 6. Кислотоустойчивые бациллы в мокроте.

Для проведения кислотостойкого окрашивания термофиксированный мазок заливают основным красителем карбол фуксином, а предметное стекло нагревают на водяной бане с паром.Тепло «плавит» восковую клеточную стенку и позволяет клеткам поглощать краситель. Затем слайду дают остыть и добавляют раствор кислоты и спирта в качестве обесцвечивающего средства. Клетки, которые являются «кислотоустойчивыми» из-за миколовой кислоты в их клеточной стенке, сопротивляются обесцвечиванию и сохраняют первичное окрашивание. Все остальные типы клеток обесцвечиваются. Затем метиленовый синий используется в качестве контрастного красителя. В конце концов, кислотоустойчивые бактерии (КУБ) будут окрашены в ярко-розовый цвет, а все другие типы клеток станут синими.

Методы окрашивания для выделения определенных клеточных структур

Капсула : полисахаридная слизь, окружающая некоторые виды бактерий и несколько типов эукариотических микробов, лучше всего визуализируется при отрицательном окрашивании клеток. В этом методе бактерии сначала смешиваются с пятном, а затем капля смеси распределяется по поверхности предметного стекла в виде тонкой пленки. При использовании этого метода капсулы выглядят как прозрачный слой вокруг бактериальных клеток с темным фоном.

Metachromatic гранулы или другие интрацитоплазматические тельца : Некоторые бактерии могут содержать окрашенные тельца-хранилища. Одним из примеров являются грамположительные бациллы Corynebacterium , которые накапливают фосфат в структурах, называемых «волютин», или метахроматических гранулах, находящихся внутри клеточной мембраны. Для визуализации внутрицитоплазматических тел у бактерий используются различные методы окрашивания, которые часто дают ключ к идентификации при наблюдении в клетках.

Окрашивание эндоспор

Эндоспоры — это спящие формы живых бактерий, и их не следует путать с репродуктивными спорами, продуцируемыми грибами. Эти структуры производятся несколькими видами грамположительных бактерий, почти всеми бациллами, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды. Две распространенные бактерии, продуцирующие эндоспоры, — это Bacillus или Clostridum . Оба живут в основном в почве и как симбионты растений и животных и производят эндоспоры, чтобы выжить в быстро и часто меняющейся среде.

Процесс эндоспоруляции (образование эндоспор) включает несколько этапов. После того, как бактериальная клетка реплицирует свою ДНК, образуются слои пептидогликана и белка, окружающие генетический материал. После полного формирования эндоспора высвобождается из клетки и может бездействовать в течение нескольких дней, недель или лет. Когда преобладают более благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры прорастают и возвращаются к активной работе в качестве вегетативных клеток.

Зрелые эндоспоры обладают высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, таким как тепло и химические вещества, что позволяет бактериям выжить в течение очень долгого времени.Эндоспоры, образовавшиеся миллионы лет назад, были успешно возвращены к жизни, просто обеспечив их водой и пищей.

Поскольку оболочка эндоспор очень устойчива к окрашиванию, был разработан специальный метод, чтобы их было легче увидеть в светлопольном микроскопе. Этот метод, получивший название endospore , краситель , использует либо тепло, либо длительное время воздействия, чтобы побудить эндоспоры поглотить первичный краситель, обычно водорастворимый краситель, такой как малахитовый зеленый, поскольку эндоспоры проницаемы для воды.После этапа обесцвечивания, который удаляет краситель из вегетативных клеток в мазке, наносится контрастное сафранин для обеспечения цвета и контраста. При окрашивании этим методом эндоспоры становятся зелеными, а вегетативные клетки окрашиваются в розовый цвет, как показано на Рисунке 7.

Рисунок 7. Бактериальные клетки с эндоспорами, окрашенные методом окраски эндоспор. Рисунок 8. Бациллы с эндоспорами, просматриваемые с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Хотя сами эндоспоры устойчивы к методу окрашивания по Граму, бактериальные клетки, захваченные в процессе создания этих структур, могут быть окрашены.В этом случае эндоспоры выглядят как четкие овальные или сферические области внутри окрашенной клетки. Эндоспоры также можно непосредственно наблюдать в клетках с помощью фазово-контрастной микроскопии, как показано на Рисунке 8.

Поскольку многие методы дифференциального окрашивания требуют нескольких этапов и длительного времени, мы не будем выполнять все методы дифференциального окрашивания, описанные выше.

Предварительно окрашенные слайды будут использоваться для визуализации бактериальных капсул, метахроматических гранул и кислотоустойчивых бацилл.Возьмите по одному слайду каждой из трех бактерий, перечисленных в таблице ниже. Просматривая эти слайды, обращайте внимание на «выделенные» структуры. У вашего изолята из окружающей среды может быть одна или несколько из этих клеточных функций, и умение распознавать их поможет в идентификации. Все это следует рассматривать с помощью масляной иммерсионной линзы объектива.

Пятно по грамму

Все процедуры окрашивания следует проводить над раковиной.Будет продемонстрирована процедура окрашивания по Граму, а ее обзор представлен в таблице 1.

Доброволец с вашего лабораторного стола должен получить культуры бактерий, которые вы будете использовать в этой лаборатории, в соответствии с указаниями вашего инструктора.Одна из культур будет грамположительной бактерией, а другая — грамотрицательной. Ниже напишите названия бактерий, которые вы будете использовать, вместе с BSL для каждой культуры:

__________________________________________________________________________________

Возьмите два предметных стекла и приготовьте мазок каждой из двух бактериальных культур, по одному на предметное стекло, как показано. Дайте ПОЛНОСТЬЮ высохнуть на воздухе и закрепите при нагревании. Окрашивайте оба мазка методом окраски по Граму.Наблюдайте за предметными стеклами с помощью светового микроскопа при увеличении в 1000 раз и запишите свои наблюдения в таблице ниже.

Пятно по Граму «Заключительный осмотр»: приготовьте мазок, содержащий смесь грамположительных И грамотрицательных бактерий, добавив небольшое количество каждой бактерии в одну каплю воды на предметном стекле.Тепло зафиксируйте мазок и окрасите его по Граму. Вы должны быть в состоянии определить реакцию окрашивания по Граму, клеточную морфологию и расположение ОБЕИХ бактерий в этом смешанном мазке. Ваш преподаватель может попросить показать этот слайд и предложить конструктивный комментарий.

Окрашивание эндоспор

Лишь несколько родов бактерий продуцируют эндоспоры, и почти все они являются грамположительными бациллами. Наиболее заметными являются виды Bacillus и Clostridium , которые естественным образом обитают в почве и являются обычными загрязняющими веществами на поверхности.Рост Clostridium spp. обычно ограничивается анаэробной средой; Bacillus spp. может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эндоспорообразующие бактерии отличаются от других групп грамположительных бацилл и различаются по их эндоспорам.

Обзор процедуры окрашивания эндоспор представлен в таблице 2.

После окрашивания эндоспоры обычно выглядят как светло-зеленые овальные или сферические структуры, которые можно увидеть внутри или за пределами вегетативных клеток, которые выглядят розовыми.

Форма и расположение эндоспор внутри бактериальных клеток, а также то, расширяет ли спорангий (D) или не расширяет (ND) стороны клетки, являются важными характеристиками, которые помогают в дифференциации между видами (см. Рисунок 9) .

Рисунок 9

1. Овальный, центральный, не растянутый (ND)
2. Овальный, концевой, ND (и параспоральный кристалл)
3. Овальный, концевой, растянутый (D)
4. Овальный, центральный, D
5. Сферический, концевой, D
6. Овальный, боковой, D

Эндоспоры довольно устойчивы к большинству процедур окрашивания; однако в мазках с обычным окрашиванием они могут быть видны как «очертания» с чистым пространством внутри. Если вы наблюдаете «очертания» или то, что кажется «призраками» клеток в мазке, окрашенном по Граму, грамположительных бацилл, то также следует выполнить окрашивание эндоспор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие эндоспор.

Волонтер из вашего лабораторного стола должен получить бактериальные культуры для окрашивания эндоспор в соответствии с указаниями вашего инструктора. Обратите внимание, что все это будут виды Bacillus . Приготовьте мазки и окрасьте каждый, используя технику окрашивания эндоспор. Посмотрите на слайды и обратите внимание на форму и расположение эндоспоры, а также на внешний вид спорангия (опухший или не опухший) в таблице ниже:

Кроме того, выберите ОДНУ из представленных выше культур и окрасите ее по Граму.Запишите свои результаты ниже в отведенных местах:

Название культуры, окрашенной по Граму: __________________________________________________

Реакция окрашивания по Граму и клеточная морфология: ______________________________________

Видны ли эндоспоры в мазке, окрашенном по Граму? _________________ Если вы видите эндоспоры, опишите, как они выглядят в препарате, окрашенном по Граму, и чем он похож и отличается от того, что вы видите в препарате, окрашенном по Граму.

Оптимизированная техника окрашивания для обнаружения грамположительных и грамотрицательных бактерий в тканях | Примечания к исследованиям BMC

Предпосылки

Помимо метаболических функций кожи, иммунные и защитные возможности кожи помогают разделить внешнюю и внутреннюю среду организма [1]. Кожная ткань — это первый физический барьер, предотвращающий проникновение микробов в подлежащие ткани хозяина. Когда этот барьер оказывается под угрозой (например,g., после ожоговой травмы) бактерии имеют возможность колонизировать ткани, что впоследствии приводит к развитию инфекции. Большое количество различных типов как острых (например, укусы, царапины), так и хронических ран (например, ожогов, язв диабетической стопы) подвержены бактериальной инфекции [2, 3]. Примерно 7–10% всех госпитализированных пациентов страдают инфекциями кожи и мягких тканей [4]. Бактериальная колонизация ран тормозит и продлевает заживление ран и усложняет клиническое ведение пациента [5].Микроорганизмы могут существовать в ранах либо в виде отдельных бактерий, либо в виде прикрепленных к поверхности сообществ, известных как биопленки, заключенные в полимерную матрицу, состоящую из белков, ДНК и полисахаридов [6]. Состояние, в котором существуют эти микробы, может иметь прямое влияние на стратегии диагностики и лечения.

Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa , грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы соответственно, являются двумя условно-патогенными микроорганизмами, которые наиболее часто связаны с поврежденной тканью у пациентов [7, 8].Отчеты показывают, что S. aureus и P. aeruginosa играют решающую роль в колонизации до 93,5 и 52,2%, соответственно, пациентов с хроническими язвами ног и ожоговыми инфекциями [9]. Ожоговые раны особенно восприимчивы к бактериальным инфекциям из-за легкости доступа питательных веществ для колонизации [10]. В частности, ожоги приводят как к потере эпидермального слоя, так и к образованию мертвой ткани, известной как струп. Денатурированные белки и липиды в ожоговом струпе создают благоприятную среду для роста бактерий, в результате чего инфекция может распространяться системно и нарушать процесс заживления ран [11, 12].

Быстрая диагностика наличия бактерий необходима для успешного лечения инфицированных ран, а клинических признаков инфекции оказалось недостаточно [13]. Идентификация микробов с помощью традиционных методов культивирования ограничена и требует времени. Более того, по оценкам, только ~ 10% микроорганизмов могут быть успешно культивированы в лабораторных условиях, что позволяет предположить, что сама по себе культура недостаточно чувствительна [14]. Следовательно, метод выявления бактерий в инфицированных ранах, который является воспроизводимым и имеет быстрое время обработки, поможет в быстром и надлежащем лечении.Учитывая ограничения традиционного культивирования, передовые методы, использующие гистологические и молекулярные методы, оказались полезными [15–17]. Хотя молекулярные методы, такие как гибридизация in situ, ОТ-ПЦР (т. Е. Секвенирование 16S рРНК) или FACS, оказались более чувствительными, они связаны с высокими затратами и длительным временем сбора данных, а также с возможностью ложноположительных результатов (например, выявление неположительных результатов). -жизненные бактерии) [18–20]. Гистологически специфические антитела (т.е. иммуногистохимия) позволяют обнаруживать отдельные виды бактерий, включая S.aureus и P. aeruginosa . Несмотря на то, что таким способом можно определить виды бактерий, эти пятна также требуют больших затрат времени и средств. Кроме того, инфекции часто бывают полимикробными, и иммуногистохимия не позволяет идентифицировать множественные организмы [7, 21–23].

В недавних сообщениях рекомендуется использовать окраску гематоксилином и эозином (H&E) вместо окраски по Граму для обнаружения биопленок / бактерий в тканях [24, 25]. Однако, хотя существующие паттерны воспаления, выявленные с помощью H&E, могут дать некоторое представление об инфекционном статусе раны, отдельные бактерии нелегко обнаружить с помощью одного окрашивания H&E [26].Кроме того, окраска по Граму позволяет различать грамположительные и грамотрицательные бактерии и является наиболее часто используемым методом для классификации бактериальных мазков in vitro. Однако в срезах тканей необходимы адаптации этого метода (например, окрашивание по Браун-Бренну, метод Гудпастуре, окрашивание по Браун-Хоппсу, Штейнеру и Штайнеру), которые приводят к преимущественному распознаванию различных организмов. Эти модификации используют уникальные белковые профили в различных бактериях, однако белки, присутствующие в ткани хозяина, неспецифически окрашиваются в этих процессах окрашивания по Граму.Следовательно, различение бактерий становится невозможным, особенно в случаях ожоговых ран, в которых бактерии присутствуют в богатом белком струпе, который сохраняет неспецифические красители как в методах Грама, так и в методах H&E [15]. В этом исследовании мы использовали модель ожога свиньи, в которой раны были инокулированы либо S. aureus, либо P. aeruginosa из-за преобладания этих организмов в клинике. Гистологические срезы были взяты для сравнения традиционных гистологических окрашиваний (например, окрашивания H&E и по Граму) с новой модификацией традиционного окрашивания по Граму.В частности, в модификации использовали контрастное окрашивание коллагена во время процесса дегидратации, чтобы противопоставить грамположительные или грамотрицательные бактериальные колонии коллагенсодержащей ткани. Наконец, мы проверили применимость этого метода окрашивания, выполнив его на клинических биопсиях пациентов, перенесших ожоговую обработку раны.

Методы

Бактериальные изоляты и условия роста in vitro

Метициллин-устойчивый изолят S. aureus был отобран из штамма USA300 в Институте хирургических исследований армии США (JBSA Fort Sam Houston, TX, США). как часть ухода за пациентами, но не имеющая отношения к исследованиям. P. aeruginosa штамм PA01 — это хорошо охарактеризованный раневой изолят, широко используемый в качестве лабораторного штамма [27–29]. S. aureus и P. aeruginosa выращивали при 37 ° C на чашках с кровяным агаром (Remel, Lenexa, KS), а затем отдельные колонии из кровяного агара инокулировали в бульон Мюллера-Хинтона с поправкой на катионы (MHB II) ( Бектон-Дикинсон, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси). Биопленки готовили, как описано ранее [30]. Вкратце, выращенные в средней логарифмической культуре бактерии (~ 10 ⁸ КОЕ / мл) разбавляли 1: 100 MHB II.Затем 250 мкл разведенных бактерий добавляли в отдельные лунки 24-луночного планшета и инкубировали в течение 48 ч при 37 ° C в статических условиях. После роста бактерии биопленки отделяли от 24-луночных планшетов путем комбинированной промывки стерильным PBS и механического разрушения с помощью пипетки. Бактериальные мазки готовили путем нанесения 50 мкл отслоившихся биопленок непосредственно на предметные стекла с последующей термофиксацией.

Сбор и обработка тканей

Это исследование было проведено в соответствии с Законом о благополучии животных, Правилами обеспечения благополучия животных и принципами Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.Протокол для животных A14-016 был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Института хирургических исследований армии США. Биопсии кожи с 11-го дня после ожога были любезно предоставлены из ранее описанной модели инфицированной ожогом свиньи, которая в настоящее время находится на рассмотрении [31]. Кроме того, человеческие образцы с удаленными ожогами были предоставлены в обезличенном виде Отделом патологии хирургических исследований армии США. Использование человеческих образцов было одобрено институциональным регулирующим органом.Биопсии животных и человека фиксировали в 10% забуференном формалине в течение не менее 48 часов и обрабатывали в течение ночи возрастающими количествами этанола с последующими тремя промываниями ксилолом и последующим уравновешиванием в парафине. Затем ткани заключали в парафиновые блоки и разрезали на срезы 6 мкм. Предметные стекла депарафинизировали, очищали в ксилоле и регидратировали при подготовке к окрашиванию.

Методы окрашивания

Специфичность антител к S. aureus и P. aeruginosa была протестирована in vitro путем гидратации биопленки или мазков планктона сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS).Затем мазки блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в трис-буферном физиологическом растворе (TBS) с 0,1% Tween 20 и 0,1% Triton X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мазки инкубировали со следующими первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре: S. aureus -FITC (разведение 1:50 в HBSS, ab68950, Abcam, Кембридж, Великобритания) или P.
aeruginosa (разведение 1: 500 в HBSS, ab74980, Abcam, Кембридж, Великобритания). После инкубации P.aeruginosa промывали HBSS и зондировали вторичным антителом alexa-fluor 594 козьего антикурицы (разведение 1: 500, ab150176, Abcam) в течение 1 ч при комнатной температуре. Оба иммуноокрашивания были завершены тремя промывками в HBSS и впоследствии закреплены с использованием ProLong Gold с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Life Technologies, Grand Island, NY). В дополнение к специфическому окрашиванию антител in vitro использовали окрашивание по Граму с использованием стандартного протокола, описанного производителем (Remel, Lenexa, KS).

Для окрашивания нормальной кожи и биоптатов инфицированного ожога ex vivo получали серийные срезы тканей, как описано выше. Чтобы проверить наличие P. aeruginosa и S. aureus, на этих срезах была проведена иммуногистохимия , идентичная описанной выше для мазков in vitro. Кроме того, срезы окрашивали H&E (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) или красителем по Граму (Remel, Lenexa, KS). Окрашивание по Граму проводилось аналогично описанным выше мазкам с небольшими изменениями (рис.1). Вкратце, кристаллический фиолетовый был нанесен на срезы ткани на 5 минут при комнатной температуре, и предметные стекла были кратковременно промыты под проточной водопроводной водой для удаления излишков кристаллического фиолетового. Грамм-йодный протрав наносили на срезы ткани на 2 мин и ненадолго промывали водопроводной водой. Чтобы удалить любое неспецифическое окрашивание кристаллическим фиолетовым, на предметные стекла наносили обесцвечивающий растворитель по Граму на 30 с, затем быстро промывали проточной водопроводной водой до тех пор, пока вода не стала прозрачной. Затем срезы окрашивали грамм-сафранином в течение 1 мин и 40 с с последующей дегидратацией с помощью ряда спиртов (95–100%) до ксилола и затем закрывали покровным стеклом.

Рис. 1

Схема, показывающая модифицированную процедуру окрашивания по Граму. Традиционная процедура окрашивания по Граму завершается в любом случае ( верхний ящик ). Основное различие в модифицированной процедуре окрашивания по Граму происходит во время процесса дегидратации и заключается в применении спиртового шафрана (, нижнее правое поле, , выделено красным цветом , ). желтый контраст в соединительной ткани (коллагене) внутри кожной ткани виден на изображениях с низким увеличением внизу (шкала шкала 1 мм)

Метод модифицированного окрашивания по Граму был выполнен таким же образом, как описано для окрашивания по Граму выше, с единственным добавлением контрастного красителя после первой стадии дегидратации 100% спиртом (рис.1). На этом этапе слайды погружали в спиртовой шафран (American Master Tech Scientific, Inc., Лоди, Калифорния) на 4 мин. После этой инкубации процесс дегидратации возобновляли, помещая предметные стекла обратно в 100% этанол, что также позволяло удалить избыток спиртового шафрана, с последующей промывкой ксилолом и закрытием покровного стекла.

Микроскопия

Изображения полной биопсии раны (как свиньи, так и человека) получали с использованием сканера слайдов AxioScan Z1 (Carl Zeiss, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк) при 10-кратном увеличении.Представляющие интерес области из серийных срезов получали с помощью микроскопа Olympus BX60, оснащенного камерой DP71 (Olympus Corporation, Токио, Япония). Были получены изображения в светлом поле, а также флуоресцентные изображения с использованием фильтров 594 нм ( P. aeruginosa ), 488 нм ( S. aureus ) или 405 нм (DAPI). Изображения с большим увеличением были получены с использованием 100-кратного объектива под масляной иммерсией.

Результаты и обсуждение

Окрашивание по Граму — наиболее распространенный метод окрашивания, используемый диагностически как в клинических условиях, так и в исследовательских лабораториях для дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в различных типах тканей [17, 26].Как видно на фиг. 2, окраска по Граму in vitro S. aureus и P. aeruginosa позволяет легко дифференцировать эти два класса организмов in vitro. Более того, это различие все еще очевидно, когда применяется как к крупным агрегатам, так и к отдельным отделившимся бактериям в биопленках, несмотря на присутствие структур в полимерной матрице, таких как углеводы, липиды и белки, которые могут влиять на пятно [32]. Для более подробной классификации бактериальных штаммов, использованных в этом исследовании, используются антитела, специфичные к S.aureus или P. aeruginosa (т.е. иммуноцитохимия) использовались в качестве инструмента проверки. Как видно на фиг. 2c, d, проиллюстрирована форма бацилл и кокковых бактерий, демонстрирующая успешную идентификацию штаммов P. aeruginosa и S. aureus, соответственно.

Рис. 2

Проверка нанесенных красителей in vitro. Обычное окрашивание по Граму показывает идентификацию грамотрицательных ( a
стр.aeruginosa) и грамположительных (b
S. aureus ) как в крупных агрегатах ( пунктирных линий, ), так и в отдельных бактериях внутри биопленки. Выбранные антитела к P. aeruginosa ( c ) и S. aureus ( d ) -антитела были использованы для подтверждения видовой идентичности культур, используемых для исследований ex vivo

Гистологически обнаружение бактериальных биопленок ex vivo осуществляется с помощью дорогих и трудоемких методов, таких как электронная микроскопия и конфокальная микроскопия [33, 34].Световая микроскопия используется для определения локализации биопленок в таких условиях, как риносинусит [24, 25, 35]. Однако в случае ожоговых ран неспецифическое окрашивание соединительной ткани, клеточного мусора и других белков, присутствующих в струпе, происходит из-за поглощения красителя кристаллического фиолетового, используемого при окрашивании по Граму [15]. Кроме того, поскольку струп содержит необходимые питательные вещества, поддерживающие рост бактерий, в этом месте часто встречаются бактерии-колонизаторы [11]. В этом исследовании мы использовали модель инфицированных ожогов на свинье, чтобы изучить модификацию традиционной окраски по Граму, которая обеспечивает контраст с соединительной тканью для лучшей визуализации бактерий.Свиньи — идеальный выбор для изучения кожных ран из-за их сходства с кожей человека. Например, кожа свиньи и кожа человека похожи по толщине эпидермиса и дермы, содержанию коллагена как в папиллярном, так и в ретикулярном слоях дермы, распределению волосяных фолликулов и схемам заживления (т.е. реэпителизации в отличие от сокращения) [36, 37].

Первоначально иммуногистохимия была проведена с ранее проверенными антителами для идентификации P. aeruginosa и S.aureus внутри ожоговой раны в этой модели (рис. 3). Рисунок 3a, d показывает, что эти бактерии не присутствуют в нормальной, необожженной коже свиньи. На рис. 3b мы демонстрируем, что специфическое антитело P. aeruginosa способно обнаруживать P. aeruginosa в инфицированных ожоговых ранах и визуализируется как скопления красных бацилл в поверхностных слоях кожи. Важно отметить, что реактивность антитела P. aeruginosa не наблюдалась ни в коже контрольной свиньи, ни в шкуре S.aureus инфицированных образцов (рис. 3а, в). Точно так же антитело S. aureus , специфически помеченное бактериями, присутствует в инфицированной S. aureus ткани, визуализируемой как зеленые кокки (рис. 3f), чего не было при ожогах, инфицированных P. aeruginosa (рис. 3c). Также было обнаружено, что локализация бактерий у этих двух видов различается. P. aeruginosa локализуется более поверхностно на ожоговом струпе, обычно в аэробной среде; тогда как S. aureus в основном располагался внутри / под струпом, в более анаэробной среде.Примечательно, что это распределение S. aureus и P. aeruginosa согласуется с более ранними исследованиями, изучающими инвазивность этих микроорганизмов в других моделях [38–41].

Рис. 3

Визуализация успешной бактериальной инокуляции ex vivo. Иммуногистохимии подвергали нормальную кожу свиньи ( a , d ), инфицированных P. aeruginosa ( b , e ) и зараженных S. aureus ( c , f ). с P.aeruginosa ( a — c ) или S. aureus ( d — f ). Обратите внимание, что эти антитела позволяют специфически маркировать бактерии ex vivo, как показано стрелками , указывающими на уникальную морфологию бактерий

Несмотря на эффективность иммуногистохимических методов, использование антител занимает много времени и дорого, а также требует предварительного знания видов бактерий, обитающих в интересующей ткани.Более того, большинство встречающихся раневых инфекций являются полимикробными. Клинически H&E является стандартным методом окрашивания, используемым патологами, и недавно он был использован для идентификации бактерий как в планктонной, так и в биопленочной формах внутри ран [24, 25]. Окрашивание H&E имеет несколько атрибутов, таких как доступность и быстрая обработка, а также способность выделять как клетки (гематоксилин), так и соединительную ткань (эозин). Однако удержание красителей, используемых в этом красителе, может привести к неправильной интерпретации сгустков и / или струпов в срезах тканей как бактерий.Как видно на рис. 4а, H&E эффективен для выделения структуры и морфологии ткани в нормальной коже свиньи с поверхностной ретикулярной дермой над характерными более толстыми волокнами папиллярной дермы. После термического повреждения H&E также эффективен для визуализации коагуляции коллагена в струпе (рис. 4b, c), поскольку отдельные волокна больше не видны. После инфицирования как P. aeruginosa (рис. 4b), так и S. aureus (рис. 4c), H&E становится неадекватным для четкой дифференциации бактериальных кластеров от остатков клеток-хозяев и компонентов струпа.Частично это связано с тем, что количество красителя, удерживаемого в срезе ткани, неспецифично (то есть одни и те же области серийных срезов темнее после срезов H&E по сравнению с другими пятнами). Кроме того, окрашивание H&E не предназначено для различения грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Основываясь на этих наблюдениях, интерпретация окрашивания H&E в тканях может быть субъективной и приводить к неубедительным, если не ошибочным, диагнозам относительно наличия или отсутствия бактерий.

Фиг.4

Модифицированное окрашивание по Граму улучшает обнаружение бактерий в срезах тканей. Серийные срезы нормальной свиной кожи ( a , d , g ), P. aeruginosa, зараженных ( b , e , h ) или S. aure us инфицированных ( c , f , i ) ожоговые раны окрашивали H&E, по Граму и по модифицированному Граму. H&E нормальной свиной кожи ( a ), P. aeruginosa, инфицированных ( b ) и S.aureus инфицированная ( c ) кожа свиньи иллюстрирует коагуляцию ткани, однако окрашивание ожогового струпа не позволяет однозначно идентифицировать бактерии. Окрашивание по Граму позволяет легко дифференцировать кластеры как грамположительные или грамотрицательные бактерии ( e , f ), однако во всех образцах ткани отсутствуют. Этот недостаток контраста смягчается с помощью модифицированного окрашивания по Граму, которое заметно усиливает обнаружение бактериальных кластеров как грамотрицательных ( ч ) или грамположительных ( i )

.

Окрашивание по Граму также обычно используется как для in vitro, так и для клинических образцов, когда у пациентов собирают культуры для идентификации бактерий [42].Хотя окрашивание по Граму является быстрым, эффективным и недорогим методом бактериальной дифференциации, оно не позволяет визуализировать соединительную ткань (то есть коллаген) в гистологических образцах. Как видно на рис. 4d, как клеточные компоненты (например, ядра), так и волокна коллагена не видны в нормальной коже свиньи. Это в первую очередь связано с отсутствием контрастного красителя (например, красителя эозина при окрашивании H&E), в котором контрастный краситель, используемый для соединительной ткани, был бы ценным для получения структурной информации.Окрашивание по Граму способно различать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы ex vivo, как показано на рис. 4e, f. Однако также очевидно неспецифическое окрашивание поврежденной ткани, что в конечном итоге может переоценить бактериальную колонизацию в тканях. Эти наблюдения приводят нас к выводу, что, хотя окраска по Граму является стандартной техникой окрашивания in vitro, ее эффективность ex vivo может привести к субъективной интерпретации, а также не может проиллюстрировать важные аспекты морфологии ткани (т.э., коллаген).

Учитывая ограничения двух ранее описанных красителей, мы стремились разработать недорогое и быстрое дополнение к красителю по Граму, которое подчеркивает структуру ткани. Для этого мы модифицировали окраску по Граму, добавив спиртовой шафран в качестве контрастного красителя. Хотя о подобном окрашивании недавно сообщили Roche et al., Описания или оптимизации техники не было [43]. Спиртовой шафран традиционно использовался в других методах окрашивания (т.е., пентахром Мовата) [44] для выделения коллагеновых волокон в образцах тканей, включая обожженную кожу [45]. Как видно на рис. 4g, коллагеновые волокна в нормальной дерме окрашиваются в желтый цвет этим раствором, что дает структурную информацию, недоступную после окрашивания по Граму. В то время как структура коллагена значительно изменяется после ожога, о чем свидетельствует коагуляция, показанная на рис. 4h, i, спиртовой шафран сохраняет способность окрашивать коагулированный коллаген. Важно отметить, что эта модификация окраски по Граму сохраняет способность различать как грамположительные (рис.4h) и грамотрицательных (рис. 4i) микроорганизмов. Контраст, обеспечиваемый спиртовым шафраном, позволяет обнаруживать бактерии глубоко внутри ожогового струпа по сравнению с одним окрашиванием по Граму (рис. 4h, e). При малом увеличении модифицированное окрашивание по Граму дает представление о колонизации инфицированных тканей путем обнаружения различий в сохраненном красном / розовом ( P. aeruginosa ) или темно-фиолетовом ( S. aureus ). При большом увеличении также легко идентифицировать морфологию бактерий (то есть кокков и бацилл).

Чтобы проверить клиническую применимость модифицированной техники Грама, такое же сравнение окрашивания было проведено на хирургических биопсиях неидентифицированного пациента (рис. 5). Критериями отбора для биопсии были пациенты с ожоговой обработкой раны, у которых была выявлена ​​полимикробная инфекция. При малом увеличении H&E, Gram и модифицированный Gram (рис. 5a, d, g, соответственно) выявили небольшое количество дермы, покрывающее значительное количество подкожных мышц.При более высоком увеличении окрашивание H&E показало задержку гематоксилина (пурпурный) как в коже (фиг. 5b), так и в мышцах (фиг. 5c) без легко идентифицируемой бактериальной морфологии. Следует отметить, что удерживание красителя во время процесса окрашивания по Граму привело к неспецифическому окрашиванию, особенно в скелетных мышцах (рис. 5f). Это было немного менее очевидно в дерме (рис. 5e), что позволило визуализировать бактерии в областях с менее плотной тканью хозяина. Однако большое увеличение модифицированного окрашивания по Граму ясно продемонстрировало бактериальную морфологию в соединительной ткани дермы (рис.5h) и подкожной мышцы (рис. 5i).

Рис. 5

Модифицированная окраска по Граму, применяемая для клинической хирургической биопсии. Серийные срезы ткани пациента, перенесшего ожоговую обработку раны, были окрашены тремя разными пятнами. Сканирование целых тканевых срезов с малым увеличением показывает небольшое количество дермы, покрывающей подкожную мышцу, с использованием красителей H&E ( a ), Грама ( b ) и модифицированного Грама ( c ). Более тщательное изучение окрашивания H&E в областях кожи ( b ) и мышц ( c ) выявило отсутствие жизнеспособных клеток-хозяев и мутные фиолетовые области.При более внимательном изучении окраски по Граму как на коже ( e ), так и на мышцах ( f ) обнаруживаются некоторые области бактериальной морфологии, которые более очевидны там, где соединительная ткань хозяина более разрежена. Более тщательное изучение модифицированного окрашивания по Граму как на коже ( х ), так и в мышцах ( i ) показывает контрастное окрашивание, которое позволяет идентифицировать бактериальную морфологию ( стрелки, ) в соединительной ткани. Увеличение врезки × 100

В то время как большое количество разнообразных молекулярных методов (например,g., пиросеквенирование 16S рРНК, гибридизация in situ, ОТ-ПЦР) уже доступны, потребуется время, прежде чем эти технологии станут достаточно усовершенствованными, чтобы они могли быстро развернуться и стать клинически возможными. Однако в гистопатологии всегда найдется место для диагностики различных тканей, и желательно иметь быстрый, недорогой, подробный и воспроизводимый гистологический метод для идентификации и локализации бактерий. Описанное нами модифицированное окрашивание по Граму улучшает традиционное окрашивание по Граму, обеспечивая контраст соединительных тканей.Оптимальное время инкубации этих тканей в спиртовом шафране составляет 4 мин. Меньшее время привело к более светлому окрашиванию соединительной ткани, в то время как более длительная инкубация в спирте начала удалять компоненты окраски по Граму. Эта 4-минутная инкубация представляет собой короткое добавление к процессу окрашивания, который уже используется в клинической практике. Хотя в этом исследовании мы использовали заливку парафином, обработка которой занимает несколько дней, стратегия мгновенного замораживания потенциально может позволить идентифицировать бактерии менее чем за час после взятия биопсии [46].

Есть потенциальные ограничения для применения этого красителя. Например, некоторые виды (например, грибы, кислотоустойчивые бактерии и другие бактерии с вариабельной грамм-переменной) не могут быть выделены с помощью окрашивания по Граму. Однако рассмотренные здесь приложения были направлены на борьбу с клинически значимыми видами бактерий, наиболее часто ассоциируемыми с раневыми инфекциями. Таким образом, эти наиболее распространенные виды, присутствующие в хронических незаживающих ранах, могут быть обнаружены с помощью описанной здесь методики. Кроме того, этот метод окрашивания не дает никаких доказательств наличия в ткани видов бактерий, которые необходимо будет устранить с помощью последующих диагностических инструментов.Кроме того, ткани, используемые в текущем исследовании, были оптимизированы для выявления инфекции, что может облегчить обнаружение по сравнению с меньшим количеством бактерий, которые могут присутствовать в острой ране. Определение того, выиграют ли раны с меньшим количеством бактерий от этого окрашивания, является предметом дальнейших исследований.

Выводы

Мы описали гистологический метод, который позволяет визуализировать тканевые структуры наряду с обнаружением грамположительных и грамотрицательных бактерий.Важным преимуществом модифицированного окрашивания по Граму является его способность выделять коллаген, что делает его применимым к любым тканям, содержащим коллаген. Использование этого метода в других образцах тканей, содержащих коллаген, может потребовать оптимизации времени окрашивания в зависимости от содержания коллагена в этом образце ткани. Поскольку кожная ткань очень богата плотными коллагеновыми волокнами, время окрашивания может быть даже короче для других тканей, в которых коллаген менее распространен и / или содержится в определенных местах (например,g., lamina propria). Мы продемонстрировали клиническую значимость этой модификации для окраски по Граму, поскольку она способна визуализировать бактерии в образцах ожоговой раны как из лаборатории, так и из операционной. В дальнейшем этот метод можно легко внедрить в клинике, что позволяет быстро исследовать статус инфекции в образцах тканей.

Окрашивание по граммам

Создано Monica Z. Bruckner

Что такое окрашивание по Граму?

Окрашивание по Граму

— это распространенный метод, используемый для дифференциации двух больших групп бактерий на основе их различных компонентов клеточной стенки.Процедура окрашивания по Граму различает грамположительные и грамотрицательные группы путем окрашивания этих клеток в красный или фиолетовый цвет. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет из-за наличия толстого слоя пептидогликана в их клеточных стенках, который сохраняет кристаллический фиолетовый цвет, которым окрашены эти клетки. В качестве альтернативы грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет, что связано с более тонкой стенкой пептидогликана, которая не сохраняет кристаллический фиолетовый в процессе обесцвечивания.

Как работает окрашивание по Граму?

Окрашивание по Граму включает три процесса: окрашивание водорастворимым красителем, называемым кристаллическим фиолетовым, обесцвечивание и контрастное окрашивание, обычно сафанином.Из-за различий в толщине пептидогликанового слоя в клеточной мембране между грамположительными и грамотрицательными бактериями грамположительные бактерии (с более толстым пептидогликановым слоем) сохраняют окраску кристаллическим фиолетовым во время процесса обесцвечивания, в то время как грамотрицательные бактерии теряют окраску кристаллическим фиолетовым. и вместо этого окрашиваются сафранином в процессе окончательного окрашивания. Процесс состоит из трех этапов:

1. Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым красителем. Затем добавляют раствор йода по Граму (йод и йодид калия) для образования комплекса между кристаллическим фиолетовым и йодом.Этот комплекс представляет собой более крупную молекулу, чем исходный кристаллический фиолетовый краситель и йод, и нерастворим в воде.
2. К образцу добавляется обесцвечивающее средство, такое как этиловый спирт или ацетон, которое обезвоживает пептидогликановый слой, сжимая и стягивая его. Большой кристаллический комплекс фиолетово-йода не может проникнуть через этот плотный пептидогликановый слой и, таким образом, задерживается в клетке грамположительными бактериями. Напротив, внешняя мембрана грамотрицательных бактерий разрушается, и более тонкий пептидогликановый слой грамотрицательных клеток неспособен удерживать комплекс кристаллического фиолетового йода, и цвет теряется.
3. К образцу добавляется контрастный краситель, такой как слабо растворимый в воде сафранин, который окрашивает его в красный цвет. Поскольку сафранин светлее кристаллического фиолетового, он не нарушает пурпурную окраску грамположительных клеток. Однако обесцвеченные грамотрицательные клетки окрашиваются в красный цвет.

Как сделать — Протокол окрашивания и проблемы:

Реактивы:

• Кристально-фиолетовый (первичная окраска)
• Раствор йода / йод по Граму (протрава, фиксирующая кристаллический фиолетовый на клеточной стенке)
• Обесцвечивающее средство (напр.г. этанол)
• Сафранин (вторичная окраска)
• Вода (желательно в шприц-бутылке)

1. Сделайте слайд образца клеток для окрашивания. Закрепите образец на предметном стекле нагреванием, осторожно пропустив предметное стекло с каплей или небольшим кусочком образца через горелку Бунзена три раза.
2. Добавьте основной краситель (кристаллический фиолетовый) к образцу / предметному стеклу и инкубируйте в течение 1 минуты. Промойте предметное стекло слабой струей воды не более 5 секунд, чтобы удалить несвязанный кристаллический фиолетовый цвет.
3. Добавьте йод по Граму на 1 минуту — это протрава или средство, фиксирующее кристаллический фиолетовый цвет на стенке бактериальной клетки.
4. Промойте образец / предметное стекло ацетоном или спиртом в течение ~ 3 секунд и промойте слабой струей воды . Спирт обесцвечивает образец, если он грамотрицательный, удаляя кристаллический фиолетовый цвет. Однако , если спирт остается в образце слишком долго, он также может обесцвечивать грамположительные клетки .
5. Добавьте вторичный краситель, сафранин, на предметное стекло и инкубируйте в течение 1 минуты.Стирать под слабой струей воды не более 5 секунд. Если бактерия является грамположительной, она сохранит первичную окраску (кристаллический фиолетовый) и не получит вторичную окраску (сафранин), из-за чего под микроскопом она будет выглядеть фиолетовой / пурпурной. Если бактерия грамотрицательна, она потеряет первичную окраску и заберет вторичную, из-за чего она станет красной при просмотре под микроскопом.

Литература

Ссылки по теме

Учебная деятельность

Микроскопия

Создано Monica Z.Брукнер, Государственный университет Монтаны, Бозман

На этой микрофотографии, окрашенной по Гимзе, показан пример слегка кислого предметного стекла, на котором образовалось пятно розового цвета. На микрофотографии показаны клетки малярии. Фото любезно предоставлено библиотекой изображений общественного здравоохранения.

Что такое окрашивание клеток?

Окрашивание клеток — это метод, который можно использовать для лучшей визуализации клеток и клеточных компонентов под микроскопом. Используя различные красители, можно предпочтительно окрашивать определенные компоненты клетки, такие как ядро ​​или клеточную стенку, или целую клетку.Большинство красителей можно использовать для фиксированных или неживых клеток, в то время как только некоторые можно использовать для живых клеток; некоторые красители можно использовать как на живых, так и на неживых клетках.

Почему окрашивают клетки?

Основной причиной окрашивания клеток является улучшение визуализации клетки или определенных клеточных компонентов под микроскопом. Клетки также можно окрашивать, чтобы выделить метаболические процессы или различить живые и мертвые клетки в образце. Клетки также можно подсчитывать путем окрашивания клеток для определения биомассы в интересующей среде.

Как окрашиваются клетки и готовятся слайды?

Методы окрашивания и подготовка клеток зависят от типа окрашивания и используемого анализа. Для подготовки образца может потребоваться одна или несколько из следующих процедур:

• Permeabilization — обработка клеток, как правило, мягким поверхностно-активным веществом, которое растворяет клеточные мембраны, чтобы позволить более крупным молекулам красителя проникнуть внутрь клетки.
• Fixation — служит для «фиксации» или сохранения морфологии клеток или тканей в процессе подготовки.Этот процесс может включать несколько этапов, но большинство процедур фиксации включают добавление химического фиксатора, который создает химические связи между белками для увеличения их жесткости. Обычные фиксаторы включают формальдегид, этанол, метанол и / или пикриновую кислоту.
• Крепление — включает прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. Клетки можно выращивать непосредственно на предметном стекле, либо свободные клетки можно наносить на предметное стекло с использованием стерильной техники. Тонкие срезы (срезы) материала, такого как ткань, также можно наносить на предметное стекло микроскопа для наблюдения.
• Окрашивание — нанесение красителя на образец для окрашивания клеток, тканей, компонентов или метаболических процессов. Этот процесс может включать погружение образца (до или после фиксации или монтажа) в раствор красителя, а затем промывание и наблюдение образца под микроскопом. Некоторые красители требуют использования протравы, которая представляет собой химическое соединение, которое вступает в реакцию с пятном с образованием нерастворимого окрашенного осадка. Протравленное пятно останется на / в образце после смывания избытка раствора красителя.

Какие бывают распространенные пятна?

Существует несколько типов окрашивающих сред, каждый из которых может использоваться для разных целей. Ниже перечислены наиболее часто используемые пятна и их действие. Все эти красители можно использовать на фиксированных или неживых клетках, а те, которые можно использовать на живых клетках, отмечены.

• Коричневый Бисмарк — окрашивает кислотные муцины, тип белка, в желтый цвет и может использоваться для окрашивания живых клеток
• Кармин — красит гликоген или животный крахмал, красный
• Кумасси синий — окрашивает белки в бриллиантовый синий, часто используется в гель-электрофорезе
• Кристаллический фиолетовый — окрашивает клеточные стенки в фиолетовый цвет в сочетании с протравой.Этот краситель используется при окрашивании по Граму
• DAPI — флуоресцентное ядерное пятно, которое возбуждается ультрафиолетовым светом, проявляя синюю флуоресценцию при связывании с ДНК. DAPI можно использовать в живых фиксированных клетках
• Eosin — контрастное окрашивание гематоксилину, окрашивает красные кровяные тельца, цитоплазматический материал, клеточные мембраны и внеклеточные структуры в розовый или красный цвет.
• Этидия бромид — окрашивает нездоровые клетки на последних стадиях апоптоза, или преднамеренной гибели клеток, флуоресцентным красно-оранжевым цветом.
• Fuchsin — это краситель используется для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрий.
• Гематоксилин — ядерный краситель, который с протравой окрашивает ядра в сине-фиолетовый или коричневый цвет.
• Hoechst красит — два типа флуоресцентных красителей, 33258 и 33342, они используются для окрашивания ДНК в живых клетках.
• Йод — используется как индикатор крахмала. В растворе крахмал и йод приобретают темно-синий цвет.
• Малахитовый зеленый — сине-зеленый контраст сафранину при окрашивании по Гименесу на бактерии. Это краситель также можно использовать для окрашивания спор.
• Метиленовый синий — окрашивает клетки животных, чтобы сделать ядра более заметными.
• Нейтральный / толуиленовый красный — окрашивает ядра в красный цвет и может использоваться на живых клетках.
• Нильский синий — окрашивает ядра в синий цвет и может использоваться на живых клетках.
• Нильский красный / Нильский синий оксазон — это пятно получается путем кипячения нильского синего с серной кислотой, в результате чего получается смесь нильского красного и нильского синего.Красный цвет накапливается во внутриклеточных липидных глобулах, окрашивая их в красный цвет. Этот краситель можно использовать на живых клетках.
• Тетроксид осмия — используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов в черный цвет.
• Родамин — белок-специфический флуоресцентный краситель, используемый в флуоресцентной микроскопии.
• Safranin — ядерный краситель, используемый в качестве контрастного красителя или для окрашивания коллагена в желтый цвет.

После окрашивания клеток и подготовки слайдов их можно хранить в темноте и, возможно, охлаждать, чтобы сохранить окрашенные слайды, а затем наблюдать под микроскопом.

Ссылки по теме и преподавательская деятельность

• Основные навыки микроскопии: учебные основы для пятен по Граму
  В этом учебном упражнении используется пошаговый процесс, чтобы помочь студентам освоить использование микроскопа, а также повысить вероятность успешного окрашивания и просмотреть микроорганизмы.
• Активность по окрашиванию клеток сети научного обучения
• Лабораторный протокол Мэрилендского университета для окрашивания по Граму
• Анимация процесса окрашивания по Граму — эта страница из Университета Северной Каролины содержит ссылку на анимацию, показывающую, как работает окрашивание по Граму (метод, позволяющий различать две группы бактерий).
• Примеры из микроскопии — доступ к этому ресурсу был получен через коллекцию цифровых ресурсов BioSciEd Net (BEN), которая представляет собой Путь Национальной научной цифровой библиотеки (NSDL) для образования в области биологических наук. Сам ресурс требует подписки или покупки активности на MicrobeLibrary.org. На этом веб-сайте есть три учебных примера (о биопленках, микробах в водоразделе и вспышке), в которых студентов просят анализировать и интерпретировать микроскопические изображения.
• Компакт-диск с атласом MicrobeLibrary — Американское общество микробиологов (ASM), член коллаборации BEN, участвующих в программе NSDL Biological Sciences Pathway, только что выпустило компакт-диск с атласом MicrobeLibrary.Этот компакт-диск содержит 329 изображений, которые отображают результаты использования стандартных микробиологических протоколов и сред, таких как окрашивание по Граму, кровяной агар, агар МакКонки, трехкомпонентный сахарный железный агар и другие. Компакт-диск MicrobeLibrary Atlas можно приобрести за 18 долларов плюс стоимость доставки и транспортировки. Чтобы сделать заказ, посетите магазин ASM.

пятен — Ресурсный центр микробиологии

Подготовка мазка

Большинство бактерий не только очень маленькие, но и очень прозрачные, и их трудно рассмотреть под микроскопом без предварительного окрашивания.Вы должны прочно прикрепить свои бактерии к предметному стеклу, прежде чем сможете их окрасить. При подготовке предметного стекла к окрашиванию необходимо учитывать два важных момента:

1. Бактерии должны быть равномерно и слегка рассеяны. Если на слайде слишком много бактерий, они образуют большой шар, и вы не сможете увидеть морфологию отдельных клеток. Большие капли клеток также не окрашиваются должным образом и могут привести к ошибочным результатам из-за неправильного окрашивания.
2. Бактерии должны быть прочно прикреплены к предметному стеклу, чтобы они не смывались во время процедуры окрашивания.Все процедуры, которые прикрепляют бактерии к предметному стеклу, приводят к некоторым морфологическим изменениям. Клетки обычно уменьшаются в размерах и демонстрируют некоторые изменения формы и внеклеточного матрикса.

Вы будете готовить слайды для окрашивания как с поверхностей бульона, так и с агара. Хотя цели одинаковы для обоих: равномерно и слегка распределенные клетки, прочно прикрепленные к поверхности предметного стекла, методы немного различаются. Окрашивание — это такое же искусство, как и наука. Несомненно, вам потребуется несколько попыток, прежде чем вы добьетесь успеха.

Материалы

• Чистые предметные стекла
• Петли или иглы для посева
• Стерильная вода
• Маркировочная ручка
• Ассорти бульонных и тарелочных культур

Меры безопасности

Будьте осторожны с аэрозолями при переносе бактерий с петли на предметное стекло. Петля очень гибкая, и с нее легко избавиться от петли, полной организмов. Не думайте, что ваш организм мертв. Фиксация тепла или метанола не гарантирует гибели организма.Выбросьте готовые слайды в ведро с дезинфицирующим средством на вашей скамейке.

Общие положения

Вы стремитесь получить легкую суспензию клеток, которая оставит на вашем слайде слабый мутный осадок. На слайде много места; используй это! Лучше сначала нарисовать круг в нижней части слайда, чтобы вы знали, где искать мазок. Очень легко запутаться, на какой стороне предметного стекла находится ваш мазок. Обязательно отметьте дальний край слайда. Делайте это последовательно на одном конце слайда, чтобы лучше сориентировать слайд.

Наберитесь терпения и дайте слайду высохнуть на воздухе, прежде чем прикреплять его к слайду. Если ваше слайд мокрый и вы закрепите его нагреванием, бактерии закипят, и клеточная морфология будет потеряна. Если ваше слайд мокрый и закрепите его в метаноле, он, скорее всего, смоет слайд. Слишком толстый мазок, скорее всего, смоет предметное стекло независимо от метода фиксации.

Мазок из бульона

Бульонные культуры обычно легче работать, потому что клетки уже разведены в бульоне.Обязательно тщательно перемешайте культуральную пробирку, чтобы бактерии оставались в бульоне.

1. Обозначьте слайд. С соблюдением правил асептики перенесите полную петлю организма в центр слайда.
2. Используйте плоскую часть петли, чтобы размазать каплю бульона по слайду. Используйте спиральные круговые движения, чтобы распределить каплю. Поскольку бульон полон белка, мазок обычно остается растянутым, а не шариками на поверхности предметного стекла.
3. Отложите слайд для сушки на воздухе.Это займет как минимум несколько минут. Не торопитесь с этим шагом.

Мазок с пластины

Петлей можно убрать множество организмов. Вы можете использовать иглу для посева, чтобы перенести свой организм на предметное стекло. Обязательно используйте стерильную воду для разбавления образцов. Обычная водопроводная вода или деионизированная вода в ваших бутылях для полоскания часто заражены бактериями.

1. Обозначьте слайд. С соблюдением правил асептики перенесите полную петлю стерильной воды в центр предметного стекла.
   • Это служит как для разведения бактерий, так и для распространения.
2. Выберите хорошо изолированную колонию.
3. Проколите его стерильной иглой или слегка зачерпните край колонии стерильной петлей.
4. Поместите иглу / петлю в центр капли и круговыми движениями по спирали распределите бактерии на предметном стекле.
5. Отложите слайд для сушки на воздухе. Это займет как минимум несколько минут. Не торопитесь с этим шагом.

Фиксация

Процедура фиксации одинакова независимо от источника мазка, чашки или бульона. Есть два метода прикрепления бактерий к предметному стеклу: фиксация тепла или фиксация метанолом. Термофиксация используется только для организмов BSL1. Организмы, с которыми мы будем работать, относятся к BSL2, поэтому вам нужно будет использовать метод фиксации метанолом. Тепловая фиксация предметного стекла может привести к образованию аэрозолей, а в случае организмов BSL2 нам необходимо максимально предотвратить это. Фиксация метанолом вызывает меньшие изменения морфологии клеток и не создает аэрозолей.

Будьте осторожны при работе с метанолом, если вы забудете, что зафиксировали его метанолом, и ваше предметное стекло не полностью высохло, оставшийся метанол загорится.

Крепление метанола (BSL2)

1. Убедитесь, что слайд полностью высох. Установите его на стойку для окрашивания над раковиной.
2. Осторожно залейте предметное стекло 95% метанолом. Оставьте на две минуты.
3. Наклоните предметное стекло и слейте метанол.
   • Коснитесь краем предметного стекла бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки метанола.
4. Отложите предметное стекло для сушки на воздухе перед окрашиванием.

Простое пятно

Простые пятна — это просто: добавьте одно пятно на фиксированное предметное стекло, дайте ему отстояться, смойте, дайте высохнуть и просмотрите. Это быстрая процедура определения наличия и морфологии бактерий в клинических образцах, таких как стул и выделения.

Метиленовый синий используется для определения морфологии веретенообразных и спирохет при инфекциях полости рта. Это также предпочтительный краситель для идентификации метахроматических гранул в Corynebacterium diphtheriae .Гранулы будут окрашивать в более глубокий синий цвет, чем у окружающих синих бактерий. Остальные виды Corynebacterium не имеют метахроматических гранул. Подойдут любые базовые красители, такие как метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый или сафранин.

Основные (катионные или положительно заряженные) красители связываются с отрицательно заряженными компонентами клеточной мембраны и цитоплазмы.

Материалы

• Метиленовый синий
• Сафранин
• кристально-фиолетовый
• Малахитовый зеленый
• Стойки для окрашивания
• Ящики для микроинструментов
• Готовые предметные стекла для мазков

Общие положения

Окрашивание — это отчасти искусство, а отчасти наука.Нет никаких жестких правил для времени окрашивания и полоскания. Указанное время — это рекомендации, которые обычно работают хорошо. Вам нужно будет поэкспериментировать с тем, что работает с вашими бактериями, и с методами, которые вы используете.

Очень важно записывать в своей лабораторной книжке именно то, что вы делаете, и наблюдаемые результаты. Вы будете повторять эти окрашивания позже в семестре и не хотите тратить свое время на повторное изобретение своей успешной процедуры окрашивания. Каждому участнику лабораторного стола будет полезно выбрать другое пятно, чтобы вы могли увидеть, как все они выглядят.

Простая процедура окрашивания

1. Поместите тщательно подготовленные фиксированные слайды для мазков на подставку для пятен над раковиной.
   • Делайте по одному слайду за раз.
   • Покройте мазок любым доступным вам основным красителем.
   • Достаточно краски, чтобы покрыть мазок. Пятно не должно стекать с предметного стекла.
2. Оставьте пятно на 1-5 минут.
3. Возьмитесь прищепкой за длинный конец предметного стекла, наклоните предметное стекло над раковиной и смойте пятно струей воды из бутылки для стирки.
   
   • Обязательно распылите над мазком и дайте ему стечь.
   • Если вы распыляете непосредственно на мазок, вы можете смыть его с предметного стекла.
   • Полоскать, пока вода не станет прозрачной или не станет слегка окрашенной.
4. Коснитесь краем предметного стекла бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки воды. Теперь вы можете дать ему высохнуть на воздухе. Или вы можете высушить его промокательной бумагой, поместив ее в книгу для промокательной бумаги и слегка надавив. Хотя этот метод быстрее, вы также можете удалить плохо прилипший мазок.
5. Просмотрите слайд под масляной иммерсией и запишите свои наблюдения в лабораторную книгу.
6. Выбросьте использованные окрашенные предметные стекла в ведро с дезинфицирующим средством в раковине.

Отрицательное пятно

Отрицательные пятна еще проще, чем простые пятна, потому что вам не нужно делать мазок. Капля клеток распределяется по предметному стеклу и просматривается без фиксации. Пятно представляет собой суспензию углерода, содержащегося в индийских чернилах или нигрозине. Углеродные частицы заряжены отрицательно, как и клеточная мембрана.Фон выглядит черным или окрашенным в цвет сепии, а клетки остаются прозрачными, поскольку они отталкивают краситель.

Некоторые положительно заряженные тельца включения, например сера, могут окрашивать. Это окрашивание дает точную информацию о морфологии клеток и наличии капсул, поскольку клетки не фиксируются. Размер клеток кажется немного больше, потому что любые внеклеточные покрытия или выделения на внешней стороне клеточной мембраны также не окрашиваются. Отрицательные окраски полезны для быстрого определения присутствия Cryptococcus neformans , возбудителя криптококциза, в спинномозговой жидкости.Этот метод также используется при окрашивании на эндоспоры и капсулы.

Материалы

• Краситель нигрозин
• Ассорти культур

Общие положения

Так же, как и при приготовлении мазка, нужно небольшое количество организма. Если у вас слишком много организмов, вы не сможете увидеть морфологию отдельных клеток. Также важно не употреблять слишком много нигрозина. Если он будет слишком толстым, фон будет выглядеть потрескавшимся, как лужи грязи, высыхающие на солнце.Вы хотите получить светлый фильм. Ваш инструктор продемонстрирует вам эту технику.

Процедура отрицательного окрашивания

1. Обозначьте слайд. Если вы работаете с бульонной культурой, поместите полную петлю организмов примерно на три четверти пути с левой стороны слайда. Если вы работаете с культурой на планшете, добавьте на предметное стекло каплю стерильной воды и разведите в ней свой организм, не растекая каплю.
2. Нанесите одну или две капли нигрозина на другое предметное стекло.Используйте стерилизованную петлю, чтобы набрать петлю, полную нигрозина. Тщательно перемешайте его с каплей клеток, не растекая каплю слишком сильно.

3. Возьмитесь за правый конец слайда правой рукой; левой рукой возьмите другой слайд под углом 45 ° или меньше к первому слайду, сразу после капли нигрозина / клеток.
4. Переместите наклонный слайд назад по поверхности первого слайда, пока он не коснется только капли нигрозина и клеток. Подождите, пока капиллярный эффект протянет жидкость вдоль передней кромки наклонного предметного стекла.
5. Протолкните угловую направляющую по поверхности плоской направляющей. Большую часть нигрозина следует оставить на исходном месте. Выбросьте предметное стекло в ведро с дезинфицирующим средством.
6. Отложите окрашенное предметное стекло в сторону, чтобы оно высохло на воздухе, прежде чем наблюдать за ним в масляной ванне. Обязательно начинайте рассматривать свой слайд с участка с тусклым серым фоном.
7. Запишите свои наблюдения в лабораторную книгу.
8. Выбросьте использованные окрашенные предметные стекла в ведро с дезинфицирующим средством.

Особое примечание

Нигрозин очень легко снимается с предметного стекла и попадает на масляную иммерсионную линзу.Не забудьте тщательно очистить масляную линзу, когда закончите. Затем очистите его снова. После того, как он высохнет на линзе, его будет очень трудно удалить, и это ухудшит вашу способность (и других микро-студентов, использующих этот телескоп) четко видеть через линзу.

Пятно по грамму

Окраска по Граму — наиболее распространенная дифференциальная окраска, используемая в микробиологии. Для дифференциальных красок используется более одного красителя. Уникальные клеточные компоненты бактерий определяют, как они будут реагировать на различные красители.Процедура окрашивания по Граму практически не изменилась с момента ее разработки в 1884 году. Практически все бактерии можно разделить на две группы: грамотрицательные и грамположительные. Некоторые бактерии являются грамм-переменными. Trichomonas , Strongyloides , некоторые грибы и некоторые цисты простейших также имеют реакцию Грама. Очень маленькие бактерии или бактерии без клеточной стенки, такие как Treponema , Mycoplasma , Chlamydia или Rickettsia , не имеют грамм-реакции.Характеристика любых новых бактерий должна включать их грамм-реакцию.

Обычно дифференциальное пятно состоит из четырех компонентов; первичное пятно, протраву, закрепляющую пятно, обесцвечивающее средство для удаления основного пятна и контр-пятно. При окраске по Граму первичная окраска — кристально-фиолетовый. Это придает ячейке интенсивный фиолетовый цвет. Протравливание, йод, образует комплекс с кристаллическим фиолетовым внутри клеточной стенки. Затем ячейку промывают обесцвечивателем Грама или 95% этанолом.Грамположительные клетки сохранят комплекс красителя и останутся пурпурными. Краситель вымывается из грамотрицательных клеток. Контркрашивание, сафранин, используется для окрашивания клеток, потерявших первичное пятно, иначе они останутся бесцветными, и вы не сможете их увидеть.

Большой комплекс йод-кристаллический фиолетовый сохраняется в клеточных стенках грамположительных клеток из-за молекулярной структуры многих слоев пептидогликана в клеточной стенке. Существует много сшитых тейхоевых кислот, и комплекс йод-краситель физически не может выйти.Кроме того, в мембране меньше липидов, и обесцвечивающий агент также не может добраться до нее. Грамотрицательные клетки имеют внешнюю мембрану и только один слой пептидогликана с большим количеством липидов. Краситель кристаллический фиолетовый легко вымывается.

Общие положения

Точность окрашивания по Граму зависит от целостности клеточной стенки бактерий. Есть множество вещей, которые могут повлиять на целостность клеточной стенки; старые клетки (т.е. культуры старше 24 часов), образец взят от кого-то, кто лечился антибиотиками, нацеленными на эту клеточную стенку, такими как пенициллин, с клетками грубо обращались или вы их фиксировали перегревом.В этих условиях грамположительные клетки будут считаться грамотрицательными. Если вы обесцвечиваете слишком долго, грамположительные клетки будут выглядеть как грамотрицательные. И наоборот, если вы недостаточно обесцвечиваете, грамотрицательные результаты будут выглядеть грамположительными. Единственный способ, которым вы можете доверять своим результатам, — это всегда проводить известные грамположительные и известные грамотрицательные результаты на одном и том же слайде. Если они окрашивают так, как предполагалось, вы можете быть уверены, что результат вашего неизвестного образца надежен.

Для правильного окрашивания по Граму требуется практика.Не ожидайте, что с первой попытки получите хорошее окрашивание по Граму. Лучше всего удерживать слайд прищепкой; Ваши перчатки станут психоделическими, как и все, к чему вы прикасаетесь!

Процедура окрашивания по Граму

1. Обозначьте слайд. Подготовьте мазки на слайде с грамотрицательным слева, неизвестным в середине и грамположительным справа.
   
   • Не забудьте поправить слайд метанолом!
2. Положите слайд на штатив для окрашивания и покройте мазки кристально-фиолетовым на 1 минуту.
   
   • Используйте ровно столько красителя, чтобы полностью покрыть мазок, но не настолько, чтобы оно стекало или капало с предметного стекла.
3. Наклоните слайд, слейте кристаллический фиолетовый цвет и ненадолго промойте водой из промывочной бутылки.
   
   • Не распыляйте непосредственно на мазки, иначе вы их смоете.
4. Залейте предметное стекло йодной протравкой на 1 минуту.
5. Наклоните предметное стекло, слейте излишки йода и аккуратно обесцвечивайте с помощью обесцвечивающего средства Грама, пока оно не станет прозрачным.
6. Наклоните слайд на бумажных полотенцах, чтобы удалить излишки красителя.
7. Залейте слайд сафранином на 1 минуту.
8. Наклоните предметное стекло, чтобы слить излишки сафранина, и осторожно промойте водой, пока он не станет прозрачным.
9. Дать слайду высохнуть на воздухе
10. Наблюдать при погружении в масло.
    • Грамположительный контроль должен быть фиолетовым, а грамотрицательный контроль — розовым.
11. Выбросьте использованное предметное стекло в ведро с дезинфицирующим средством.

Капсульный краситель (клебсиелла)

Краситель Congo Red Capsule Stain

Краситель Congo Red Capsule — это модификация отрицательного окрашивания на нигрозин, которое вы, возможно, делали ранее. Бактерии поглощают краситель конго красный, и фон окрашивается кислотным красителем фуксин. Слои капсулы или слизи из высокогидратированных полимеров исключают оба красителя. Фон станет синим, бактериальные клетки — розовыми, а прозрачные ореолы — это капсулы.

Клинически капсулы некоторых высокопатогенных бактерий (т.д .: пневмококки, Haemophilis influenzae и менингококки), можно различить с помощью антисыворотки, специфичной для этого типа капсул. Бактерии суспендируют в антисыворотке, а затем смешивают с метиленовым синим. В ходе процедуры окрашивания антисывороткой бактерии будут выглядеть синими, окруженными прозрачным ореолом, а затем окруженными тонкой синей линией там, где антисыворотка прикрепилась к капсуле.

Материалы

• Конго Красное пятно
• Кислотный фуксиновый краситель
• Кислотный спирт
• Klebsiella pneumoniae посев
• Enterobacter aerogenes Культура

Процедура окрашивания красной капсулы Конго

1. Поместите полную петлю Congo Red на горку
2. Смешайте небольшое количество вашего организма с каплей Congo Red.
   
   • Хорошо распределите суспензию микроорганизмов / красителя на предметном стекле
3. Дайте слайду полностью высохнуть на воздухе.
4. Зафиксируйте высохшее предметное стекло кислотным спиртом на 15 секунд.
5. Промойте дистиллированной водой и покройте предметное стекло кислотным фуксином на 1-5 минут.
6. Промойте водой и дайте высохнуть на воздухе.
7. Осмотрите предметное стекло при погружении в масло.
   
   • Клетки окрашиваются в красный / розовый цвет, а капсулы выглядят как бесцветные ореолы на темно-синем фоне.

Эндоспорное пятно Виртца

Образование эндоспор характерно для видов Clostridum и Bacillus spp. Способность концентрироваться и покрывать свою протоплазму позволяет им выжить в неблагоприятных условиях окружающей среды, с которыми они сталкиваются в своей почвенной среде обитания. Это также позволяет спорам сопротивляться окрашиванию. «Живые» организмы легко визуализировать с помощью простых красителей и красителей по Граму.

Эндоспоры обычно обладают высокой преломляющей способностью, свет, падающий на них, отклоняется.Многие виды Bacillus имеют тела включения, которые обладают высокой рефрактильностью. Эти тельца включения могут выглядеть как эндоспоры при регулярном окрашивании. Присутствие эндоспор необходимо подтверждать с помощью красителей, специфичных для эндоспор. Наличие, характерная форма и положение эндоспор требуют специальных процедур для проникновения через слой эндоспор. Большинство пятен на эндоспоре связано с нагреванием предметных стекол, при этом они постоянно увлажняются красителем. Хотя он быстрее, он производит летучие химические вещества и представляет собой большой беспорядок.Те же результаты можно получить, оставив краситель на предметном стекле в течение 30 минут. Рекомендуется сначала запустить этот слайд и поработать над другим пятном, пока вы ждете, пока краситель проникнет в эндоспору.

Общие положения

Вы будете использовать вид Bacillus для окраски эндоспор. Форма и положение спор B. cereus очень похожи на споры B. anthracis . Bacillus не начинает образовывать споры, пока не закончится еда.Если культуры слишком молодые, вы в основном увидите только розовые палочки бактерий. Если культуры слишком старые, вы в основном увидите только маленькие зеленые овалы эндоспор. В идеале вы должны видеть зеленые овальные тела эндоспоры, окруженные розовой вегетативной бактериальной клеткой. Для получения наилучших результатов выберите образец из середины колонии с помощью прямой посевной иглы. Край колонии все еще активно растет и будет иметь мало эндоспор.

Материалы

• Малахитовое зеленое пятно (5%)
• Сафранин (0.25%) — пятно контрацептора
• Bacillus spp. плита

Процедура окрашивания эндоспор Wirtz

1. Сделайте мазок на Bacillus и зафиксируйте метанолом.
2. Залейте мазок малахитовым зеленым пятном.
3. Дайте пятну отстояться не менее 30 минут .
   
   • Добавьте еще пятна, если оно начнет сохнуть.
4. Промойте предметное стекло дистиллированной водой.
5. Залейте предметное стекло сафранином (0,25%) на 1-5 минут.
6. Промойте предметное стекло дистиллированной водой и дайте высохнуть на воздухе.
7. Наблюдать при погружении в масло.
   
   • Эндоспоры имеют голубой цвет, а бактериальные клетки розовые.

Процедуры для студентов

Процедуры для студентов

Процедуры для студентов

Цель: — определить
Окраска по Граму
ваш бактериальный образец.

Введение: Окрашивание по Граму является широко распространенным методом
привыкший
определить химический состав клеточной стенки бактерий.В
клеточная стенка может
окраска может быть положительной или отрицательной, в зависимости от химического состава.
Зная
химический состав облегчает манипулирование бактериями для
различный
целей. Медицинские, исследовательские, опытно-конструкторские и биотехнические
поля просто
несколько профессий, величайшие научные достижения которых были обусловлены
к знанию
химический состав клеточной стенки бактерий. Если бактерии
пятна положительные
он сохранит пурпурный / синий цвет.Если бактерии окрашивают
отрицательный,
бактерии не сохранят пурпурный / синий цвет, а будут иметь
розоватый / красный
цвет.

Процедура:

1. Смажьте и закрепите чистое предметное стекло с помощью нагревателя.
бактериальная культура.

2. Нанесите от 10 до 15 капель красителя кристально-фиолетового на бактерии.
мазок и
оставьте на одну минуту.

3. Смойте пятно кристально-фиолетового цвета водой (с
бутылка для стирки).

4. Нанесите пятно Грамма на мазок и оставьте на один
минута, тогда
смойте водой из бутыли для стирки.

5. Добавьте от 10 до 15 капель 95% этанола и оставьте на 10-15 капель.
секунд.
Смойте водой для бутыли для стирки.

6. Поместите Safranin на предметное стекло и оставьте на 45 секунд.
Смыть
водой из стиральной бутылки. Добавьте покровное стекло.

7. Посмотрите под микроскопом. Определите, действительно ли ваш
бактериальная культура
окрашены положительно или отрицательно.

Вопросы

1. Почему важно соблюдать стерильность?

2. Что может вызвать появление грамположительных бактерий?
грамотрицательный?

3. Назовите три грамположительных бактерии и болезни, которые они вызывают.

4. Назовите три грамотрицательных бактерии и болезни, которые они вызывают.

Для дальнейшего изучения

Перейти на этот сайт по микробиологии,
выберите «Клетка» и назовите 4 функции клеточной стенки. Выбирать
«Грамотрицательные бактерии» и объясните, почему грамотрицательные бактерии
не буду
удерживайте кристально-фиолетовое пятно.