Окрашивания фото: Интересные окрашивания волос (38 фото)

Содержание

Модное окрашивание опал – тренд. Есть, что выбрать! Много фото

Поспешите получить самую правдивую информацию, представленную нашими экспертами – знатоками парикмахерского искусства!

Хотите, чтобы по вашим волосам разлилось северное сияние? Тогда вам стоит испробовать на себе новую технику окрашивания волос под названием опал! Именно этот вид колорирования собрал под свои знамена блондинок, брюнеток и шатенок со всего земного шара!

Опал получается при объединении такого тренда как седые волосы с радужным окрашиванием. Название тенденции происходит от названия драгоценного камня, который переливаясь, играет зелеными, малиновыми, фиолетовыми и красными оттенкам. Получаемый от модного окрашивания эффект действительно очень напоминает красоту этого камня.

Тонкости парикмахерского искусства

Итак, окрашивание техникой опал представляет собой создание на волосах многогранной палитры мягких полутонов с помощью нанесения различных оттенков краски на локоны. Самый первый звоночек о «чудо- окрашивании» прозвучал, когда стилисты играли с полутонами блонда. Получившийся результат поразил всех своим эффектом голографического сияния!

Поскольку волосы играли холодными оттенками драгоценного опала, было решено назвать эту технику именем камня. После того как эксперименты на блонде были закончены, мастера парикмахерского дела перешли на другие цветовые гаммы.

Поклонницы рыжего и русого оттенка также получили возможность создания на своих волосах удивительно по своей красоте объемного колорирования. Но в этом обзоре мы поговорим именно о блонде.

Почему очень часто именно блондинки выбирают опал

Благодаря этой уникальной технике вы достаточно быстро из переберетесь из «надоевшего» морозного блонда в новую цветовую палитру.

Для тех, кто безуспешно борется с сединой, опал – повод порадоваться. Вы можете красиво обыграть седые прядки и не переживать о том, что поседевшие локоны будут быстро отрастать, контрастируя на фоне окрашенных волос.

Блондинки не понаслышке знакомы с проблемой желтых прядей, с окрашиванием опал этого не будет, уверяем вас!

Кому подходит техника окрашивания?

Совсем не важно, «какой вы масти». Для того чтобы создать сияющий множеством цветов блонд, понадобится просто обратиться к хорошему мастеру.

Темные шатенки и брюнетки должны помнить, что для кардинального преображения с помощью окрашивания опал вашим волосам придется выдержать 3 этапа осветления, что может сказаться не лучшим образом на их состоянии. Поэтому обращаться можно только к профессионалу своего дела!

Создать сияние на своей голове могут как обладательницы длинных волос, так и дамы с короткой стрижкой. Опал отлично смотрится в прическе, но даже если вы просто распустите волосы, то будете выглядеть не менее привлекательно.

Универсальность колорирования морозными оттенками блонда в том, что и на гладких и на кудрявых волосах он смотрится органично и создает образ волшебной принцессы из далекой и сказочной страны.

Варианты окрашивания

По-настоящему стильные девушки не боятся экспериментировать и выбирают оттенки нежной лаванды, бирюзы и кварца. Особенным шиком отличается такая техника на крупных локонах. А в романических прическах со сложным плетением мастера создают настоящие шедевры, когда прическа девушки напоминает живые цветы диковинной красоты!

Самые смелые дамы выбирают для тонирования волос насыщенные оттенки: солнечно-желтый, малиновый, пурпурный. Такой вариант вряд ли подойдет для работы, зато на вечеринке вы без сомнения будете королевой!

На коротких стрижках и прямых волосах окрашивание опал смотрится не менее впечатляюще, если, конечно, работа была выполнена настоящим мастером, а не вами или вашей подружкой в целях «эксперимента».

Важно учитывать еще один момент, а именно – необходимость постоянной поддержки окрашивания. Отросшие корни считаются недопустимым моветоном!

Хотите кардинально поменять свой образ? Тогда техника окрашивания опал – для вас!

Окрашивание опал. Фото

А вам нравится такое решение?

Мастер запостил окрашивание волос клиентки и стёр её самооценку. На фото не только причёска новая, но и лицо

Парикмахер сделал фото клиентки после окрашивания волос, но слегка увлёкся сменой её образа. Теперь на фото после блогершу не узнает даже мать, ведь, как оказалось, мастер он не только по волосам, но и по фотошопу. Правда, после блистательных навыков стилиста самооценку его посетительницы уже не спасти.

Социальные сети — отличный способ найти новых клиентов для мастеров бьюти-индустрии. Поэтому люди уже давно не удивляются, когда мастер просит сделать их фото после завершения своей работы. Правда, результат на картинке не всегда совпадает с тем, что был в реальности, в чём убедилась пользовательница тиктока под ником spaghettileti6969.

Тиктокерша рассказала, что была на окрашивании у мастера

По словам девушки, недавно она посещала парикмахера, чтобы сделать новое окрашивание в технике балаяж и укладку. Когда работа была закончена, мастер не сделала фото после. Однако спустя время она написала клиентке и попросила прислать селфи, чтобы она могла разместить его в своих соцсетях для собственного портфолио. Тиктокерша согласилась и отправила обычный снимок с лёгким макияжем, не прибегая к ретуши и обработке кадра.

Фото, отправленное клиенткой

После отправки фотографии мастеру клиентка пошутила: она надеется, что он не будет фотошопить её снимок, прежде чем разместить его на своей странице. Однако когда она увидела своё фото в ленте парикмахера, то не сразу узнала снимок.

Клиентка не поверила глазам, увидев на фото не себя, а модель с гламурными тенями на веках и идеальной кожей, словно под огромным слоем косметики. В конце своего видео девушка не смогла сдержать смех, взглянув на своё обработанное фото снова.

Фото, которое запостил мастер

Видео, которое посмотрели почти 600 тысяч раз, рассмешило зрителей. Многие признали, что считают поступок мастера неприемлемым и довольно грубым. Нахального парикмахера раскритиковали в комментариях за непрофессиональное поведение.

Это так ненормально. Ты и раньше выглядела потрясающе.

Селфи, которое вы сделали, было великолепным. Не могу поверить, что он отредактировал его, это так грубо.

Тогда в чат вошли другие мастера из бьюти-индустрии, добавив, что тоже редактируют фото своих клиентов, правда, их лица — никогда.

Как визажист я редактирую фото своих клиентов, чтобы сделать их лучше и ярче, но никогда не трогаю их лица. ОМГ.

Некоторые добавили, что это проблема не только отдельных мастеров, но и всего общества, которое привыкло воспринимать ненастоящие лица, считая реальность менее непривлекательной.

Что не так с нашим обществом.

Другой девушке повезло ещё меньше — она сделала фото на паспорт, но фотограф сменил ей не имидж, а пол. Снимок заряжен на недоумение кассирши в магазине.

Иногда результат работы мастера удивляет не на фото, а в реальности, как в случае с пьяным мастером, который нарастил девушке волосы запрещённым приёмом. Сделать с ней такое мог бы только Джеки Чан ногой.

пошаговое фото, видео показывает, как покрасить локоны самой

Очень часто окрашивание волос в домашних условиях оканчивается очередным фиаско. Это связано с тем, что нарушается техника окрашивания волос в домашних условиях и в результате получается неравномерное распределение красящего вещества или недостаточное время экспозиции. Если все-таки хочется научиться этому мастерству, то потребуется изучить детально предлагаемый материал о том, как покрасить локоны самой себе.

В нем рассказано о том, как проводится самостоятельное окрашивание волос в домашних условиях и на какие нюансы стоит обратить пристальное внимание. Если соблюдать все рекомендации мастеров парикмахерского искусства, то домашнее окрашивание волос получится равномерным и достойным внимания окружающих людей. Перед проведением процедуры стоит приготовить красящий состав и все необходимые инструменты. Также перед тем, как сделать окрашивание волос в домашних условиях, рекомендуется проверить состояние локонов и по мере необходимости провести их лечение. Это стоит делать до момента нанесения красящего состава. Если не провести восстановление, то возможно получение не корректного результата.

Посмотрите, как проводится окрашивание волос в домашних условиях — на фото пошагово показан весь технологический процесс этой процедуры:

Как правильно покрасить волосы краской самой себе

Чтобы красить волосы, как профессионал, нет нужды посещать школу юного химика. Следуйте нашим рекомендациям, и бьемся об заклад, что ваш парикмахер не заметит изъяна.

Хотя косметические средства для окрашивания волос дома более чем совершенны, они не могут сравниться с руками парикмахера. Иными словами, невозможно превратиться из брюнетки в блондинку, избежав рыжины, если вы делаете это сами. Впрочем, блондинке не менее сложно стать брюнеткой или рыжей так, чтобы полинявший цвет не выглядел просто отвратительно. Зато, если вы хотите стать на тон или два светлее или добавить блеска своему естественному цвету, все нормально. И, конечно, нет более совершенного оружия, чтобы скрыть седину, имитируя свой натуральный цвет.

Существует три типа домашнего окрашивания. Перед тем, как покрасить волосы самой себе, вспомните о том, что существуют недолговечные оттеночные средства. Они придуманы для того, чтобы ненадолго придать определенный тон и блеск волосам (как правило, можно помыть голову от 6–8 раз) и ничуть не закрашивают седину. Они хороши на один выход или чтобы без особого труда придать своим волосам такой красивый, но такой нестойкий медный оттенок.

Перед тем, как правильно покрасить волосы самой себе, выбирайте подходящие прочные средства. Они способны на несколько недель скрыть до 50% седых волос, но у корней краска постепенно размывается. Наконец, есть средства для перманентного окрашивания. Стоит дважды подумать, прежде чем решиться на это, поскольку такие продукты разрушают волосяное волокно, изменяя его цвет навсегда. Только они способны полностью закрасить седину, по крайней мере, на месяц, поскольку у корней волосы отрастают.

Перед тем, как покрасить волосы краской самой себе, нужно выбрать оттенок своей мечты, для этого внимательно рассмотрите естественный цвет собственных локонов. Действительно, мы всегда думаем, что наши волосы темнее, чем на самом деле. Что, если вы не брюнетка, а «всего лишь» темная шатенка? Проверьте цвет, сравнив свои волосы с образцами цвета на витрине. Если над вами будут смеяться, это не смертельно, зато вы избежите кучи неприятностей.

До того, как провести пошаговое окрашивание волос в домашних условиях, разложите перед раковиной или на бортике ванной все, что вам необходимо. То есть полотенце, которое вам не слишком нравится (вы его обязательно запачкаете), латексные перчатки (перчатки прилагаются к комплекту с краской, но они часто неважного качества, лучше зайти за ними в отдел хозяйственных товаров), щетку для волос, заколку-краб и все, что лежит в коробке.

Как дома покрасить волосы самой себе: фото пошагово

Перед тем, как покрасить волосы дома самой себе, нужно тщательно смешать и приготовить красящий состав. Средство для окрашивания волос состоит из двух смешиваемых продуктов (красящая основа и пигментирующий состав), хорошенько размешайте смесь, чтобы не осталось комочков. Кроме того, подготовьте волосы, расчесав их от корней до кончиков, а потом зачешите размашистым движением справа налево и слева, и направо, чтобы проветрить. Намочите волосы, если так указано в инструкции. Заметьте, если наносите красящий состав на сухие волосы, лучше, чтобы они были грязноваты, то есть защищены натуральным кожным жиром.

Возможны два варианта: либо ваши волосы уже были окрашены, либо это ваш первый опыт. В первом случае нанесите краску только на корни и выдержите не менее половины рекомендованного времени, прежде чем размазывать по всей длине волос. В противном случае нанесите краску на все волосы и выдержите именно столько времени, сколько указано в инструкции. Вы боитесь промахнуться? Чуть сократите время выдержки. То же самое, если отросшие волосы и кончики суховаты. Поврежденные волосы склонны очень быстро поглощать пигменты, в результате чего пряди становятся немного жесткими.

Далее показано, как покрасить волосы самой себе на фото, иллюстрирующих процесс нанесения красящего состава на локоны:

Как бы то ни было, прежде чем намазывать краску на волосы, нанесите по контуру лица увлажняющий крем, чтобы уберечь кожу от краски. Наконец, нанесите краску на волосы прядь за прядью, не забыв методично проводить кисточкой полосы на голове, чтобы не пропустить половину корней. Как только все волосы покроются каской, заколите их заколкой-крабом и, если краска безобразно течет, оберните голову полотенцем.

Хотя современные составы для окрашивания обогащены маслом какао (или фисташек) и не содержат аммиака или других устрашающих веществ, волосы в результате их воздействия, тем не менее, становятся более чувствительными. Именно поэтому в коробку кладут кондиционер. Не ограничивайтесь этой дозой и, смыв краску шампунем, сделайте маску, особенно если пользуетесь средством для перманентного окрашивания.

Посмотрите, как покрасить волосы самой себе: фото пошагово иллюстрируют всю технику проведения данной процедуры:

Как дольше сохранить цвет волос после окрашивания

Всего несколько недель назад вы были изысканной брюнеткой/шатенкой/блондинкой. Но волосы, как и одежда, линяют после мытья, и ваш огненно-рыжий цвет — не исключение из правила. Ух, в отличие от натурального цвета, окрашенные волосы можно восстановить. Нужно знать, как сохранить цвет волос после окрашивания с помощью простых и эффективных методов.

Перед тем, как сохранить цвет волос, купите шампунь для окрашенных локонов. Это не просто «маркетинговое» название, ведь эти косметические продукты содержат полимеры, которые покрывают волосы, закрепляясь на волокнах волос и защищая их от вредного внешнего воздействия. Как правило, в их состав входит много питательных веществ (масло карите, пальмовое масло…), которые восстанавливают волосы, ослабшие после окраски. Некоторые из этих шампуней действуют довольно избирательно на светлые, темные или рыжие волосы. В этом случае они содержат натуральные экстракты, слегка изменяющие оттенок волос. Именно так действуют на темные волосы ромашка или хна.

Продаются также шампуни (для профессионалов), способные, благодаря добавке дополнительного цвета, изменить отблеск волос. Например, с помощью фиолетовых пигментов можно нейтрализовать желтый отблеск светлых волос. Идеальный вариант, если наша Мэрилин превратилась в желтую Барби, злоупотребив солнечными ваннами

Существует множество способов, как дольше сохранить цвет волос и некоторые из них легко можно применять в домашних условиях. Если цвет, переливающийся после посещения салона, поблек после того, как вы несколько раз вымыли голову — приобретите средство для репигментации. Существуют средства для любых волос, которые имеют свои особенности, в зависимости от их цвета — светлого или темного. Как это делается? Пигмент наносят по всей длине волосяных стержней, не касаясь кожи головы, как это происходит при окрашивании. Нанесите средство, как маску, на всю гриву и оставьте на рекомендованное время (как правило, не более чем пять минут!). Не бойтесь, если средство нанесено неравномерно, это не настоящая окраска, поэтому вы не рискуете превратиться в зебру. Результат этого мошенничества держится до следующего мытья головы. Внимание: такие насыщенные пигментами средства обычно пачкают и ванну. Сразу сполосните ее, чтобы потом не пришлось отчищать.

Как только вы тщательно промоете волосы (от двух до трех минут под струей воды не слишком экологично, но необходимо для чистоты), напоследок ополосните их с уксусом. Некоторые хитрые производители создали специальные косметические продукты (для законченных лентяек), но ни один из них не сравнится со старым бабушкиным рецептом: добавить стакан уксуса при последнем ополаскивании волос. Благодаря его сказочной кислотности волосяные чешуйки сокращаются, и волосы начинают ярко сиять. Или просто ополосните волосы холодной водой. Бррр, холодно! Да, но потерпите ради собственного блага: ледяная вода действует на волосы так же, как уксус, и не пахнет!

Часто говорят, что для здоровья волос лучше сушить их на воздухе. Это правда. Но, поглощая воду, они тяжелеют и тускнеют. Оптимальный выбор: отжать волосы до последней капли и быстро высушить феном на максимальной мощности, чтобы вода немедленно испарилась.

Как сохранить цвет окрашенных волос

Если цвет ваших волос потускнел, но они слишком слабы для окрашивания — потратьтесь на средство для временного тонирования, которое можно сделать дома. Смешайте его с таким же количеством пальмового или любого другого питательного масла и нанесите по всей длине волос, как маску, и выдержите указанное в инструкции время. После этого волосы не только вернут себе цвет, но заметно похорошеют благодаря воздействию масла и заблестят так же, как в рекламе шампуня в глянцевом журнале. Вы продержитесь целый месяц до следующего «настоящего» окрашивания в салоне. Перед тем, как сохранить цвет окрашенных волос, обязательно поинтересуйтесь, с помощью каких природных красителей можно поддерживать яркость тона.

Несмотря на все усилия, вы не добились цвета, о котором мечтали? Клин клином вышибают: решитесь на перманентное окрашивание, насыщающее волосы пигментами от корней до кончиков. Этот подвиг можно совершить дома, если немного потренироваться или если у вас есть добрая подружка. Прежде чем начать, внимательно прочтите инструкцию и, если по-прежнему опасаетесь, посмотрите ролики на сайтах.

Как восстановить натуральный цвет волос после окрашивания в домашних условиях

Перед тем, как восстановить натуральный цвет волос, нужно его определить с помощью специальной шкалы и затем подобрать соответствующий ему оттенок краски. К сожалению, сразу вернуть естественную окраску невозможно. Поэтому, перед тем, как восстановить цвет волос после окрашивания, придется один раз все-таки еще нанести красящий состав на локоны.

В качестве бонуса предлагаем три правила, которые следует соблюдать, чтобы восстановить цвет волос в домашних условиях и получить отличный оттенок:

  1. Никогда не покрывайте краской отросшие волосы! Более пористые отросшие волосы и кончики волос быстро «схватываются». Значит, нужно нанести краску на корни и выдержать половину рекомендованного времени, потом размазать ее по отросшим волосам, а после этого по кончикам.
  2. Смывайте как можно больше! Нужно остановить воздействие красителя. Ополаскивая волосы в течение нескольких минут, вы замечаете, что вода окрашена, следовательно, средство еще действует!
  3. После окрашивания нанесите на волосы средство для глубокого ухода. Несмотря на все разработки, волосы очень чувствительны к окисляющим красителям. Если после окрашивания не рекомендуется мыть голову шампунем, чтобы не смыть пигменты, обязательно нужно нанести на выжатые волосы поставляемое вместе с краской средство для ухода. И пользоваться им после каждого мытья волос.

Иногда полезно вспомнить старые добрые бабушкины рецепты о том, как восстановить цвет волос после многократных колористических экспериментов. Этот, во всяком случае, чертовски эффективен для девушек со светлыми волосами, желающих стать белокурыми, как младенцы. Смешайте две капли лимонного эфирного масла, три капли ромашкового эфирного масла и столовую ложку уксуса в литре воды. Вымыв голову шампунем и ополоснув волосы, нанесите эту смесь и дайте высохнуть. Платиновой блондинкой вы, разумеется, не станете, но для красивого отблеска — гениально.

Полезный совет. Не всегда удается объяснить парикмахеру, в какой цвет вы хотите покрасить волосы. И правда, как правило, цвет получается темнее естественного. Большинство девушек- шатенок считают себя брюнетками, тогда как парикмахеры ассоциируют этот цвет с угольно-черным. То же самое касается блондинок: то, что мы считаем светло-каштановым, колористы, на самом деле, называют темно-русым. Заключение: лучше обсуждать с ними эту тему с фотографиями в руках.

Посмотрите, как проводится окрашивание волос в домашних условиях – на видео представлена процедура, описана техника её самостоятельного осуществления:

Окрашивание сомбре: модная техника (фото)

Последние несколько лет на пике популярности пребывало градиентное окрашивание – омбре. Многие представительницы прекрасного пола в погоне за модной тенденцией штурмовали салоны красоты, чтобы сделать свои локоны еще более привлекательными. В настоящее время ситуация изменилась и на смену омбре пришел новый вид — окрашивание сомбре. Давайте более детально поговорим о нем и разберемся, что к чему.

Что такое Сомбре

Новинка отличается своей естественностью и натуральностью. Название “Сомбре” произошло от двух английских слов “soft,subtle +ombre”, т.е. “мягкое, щадящее омбре”. Использование нескольких оттенков позволяет создать эффект легкого солнечного блика и тем самым освежить прическу.

Особенности окрашивания

Техника сомбре позволяет придать объем и не предусматривает детальной проработки прядей краской. По этой причине многие девушки с успехом производят все манипуляции в домашних условиях. Окрашивание не предусматривает использование фольги, потому что необходимости в наличии четких границ нет. Состав, обладающий осветляющим эффектом, необходимо наносить очень быстро и выдерживать достаточно длительное время. Поэтому прежде, чем приступить к процедуре, необходимо располагать достаточным количеством времени и обзавестись терпением.

Отличие Сомбре от Омбре

Обе техники предусматривают окраску некоторых прядей в светлый оттенок. Именно этот метод позволит добиться эффекта выгоревших на солнце прядок, придать дополнительный объем, “живость” и эффектный внешний вид. Несмотря на схожесть Омбре и Сомбре все же эти техники имеют ряд отличительных особенностей.

Критерий Омбре Сомбре
Цвет Темные корни и светлые концы, а между ними – нечеткая граница. Блики на отдельных прядках. В этом случае корни могут быть немного светлее длины, а граница незаметна.
Уровень окрашивания Переход к светлому предусматривается с середины длины волос или несколько ниже. Окрашивание начинается примерно на расстоянии 5 см от корней. Осветляются только некоторые прядки.
Контрастность Переход от темного к светлому заметен. Мягкий и плавный переход.

 

Кому идет

Сомбре подходит и обладательницам темных локонов, и светловолосым девушкам. Пряди и в том и в другом случае приобретут удивительный эффект выгоревших на солнце. К тому же такой вид окрашивания подойдет не только юные особы, но и женщинам, которые то-ли в силу возраста то ли из-за вида деятельности не могут сделать волосах более контрастный переход.

Сомбре на темных волосах

Сомбре позволяет сделать прическу более объемной, а также подчеркнуть глубину цвета, его яркость и насыщенность. Главное – сделать правильный выбор светлой краски.

Темно-русые: какой оттенок выбрать

Девушкам с темно-русым цветом волос стоит отдать предпочтение приглушенным и спокойным оттенкам. Обратить внимание можно на пепельно-русый, платиновый, морозный каштановый и “белый песок”.

Каштановые — какой оттенок выбрать

Обладательницам каштановых волос рекомендуется присмотреться к карамельным, ореховым и золотистым оттенкам.

Черные – какой оттенок выбрать

Трудности с окраской сомбре могут испытывать девушки с угольно черным цветом волос, так как для него трудно подобрать подходящий оттенок, который бы гармонично сочетался с природным цветом. В этом случае на помощь придет квалифицированный мастер-колорист.

Сомбре на светлых волосах

Градиентное окрашивание Сомбре на светлых волосах позволит сгладить разницу между отросшими корнями и осветленными волосами. Колорирование на светлые волосы можно делать благодаря бликам. На слишком светлых локонах они будут выглядеть, как будто на прядь направлен луч света. Блики располагают в средней части локона. Эффектно они будут смотреться на кудрявом каре.

Русые – какой оттенок выбрать

Обладательницам русых волос подойдет оттенок лесной орех, карамель или кофе с молоком. Такой переход будет выглядеть максимально эффектно и стильно.

Светло-русые — какой оттенок выбрать

Если вы обладательница светло-русых волос и не знаете какой оттенок выбрать для окрашивания в технике Сомбре, тогда обратите внимание на оттенки – светлая ольха, холодный бежевый блонд и светло-русый пепельный.

Блонд – какой оттенок выбрать

Возможности при выборе цвета для сомбре для блондинок ограничены, так как оттенить и так очень светлые волосы довольно сложно.

Техника окрашивания

Окрашивание в технике сомбре – процедура не сложней обычного окрашивания, только осуществляется оно по другой схеме. Давайте рассмотрим подробнее.

Необходимые инструменты

Для окрашивания волос в технике Сомбре в домашних условиях необходимо обзавестись:

  • кисточкой для окрашивания и перчатки
  • неметаллической емкостью для состава
  • заколками
  • набором расчесок
  • часами
  • старыми полотенцами
  • осветлитель/краситель

Чтобы осуществить процедуру окрашивания Сомбре стоит заранее подобрать осветлитель для локонов и краску соответствующего оттенка.

Как сделать

Сначала необходимо нанести краску по всей длине, по истечении 5 минут смыть, а после нанести повторно, но уже немного ниже. Такая схема позволит добиться максимально плавного перехода цвета.

Шампунь-стабилизатор после окрашивания – для чего

Уход за локонами после Сомбре не отличается от ухода после обычного окрашивания. Поэтому после процедуры голову необходимо вымыть с шампунем-стабилизатором, чтобы закрепить цвет и обеспечить его стойкость.

Как ухаживать за волосами после окрашивания

Окрашивание может стать причиной ломкости и сухости волосков. Поэтому после проведения процедуры необходимо обеспечить локонам надлежащий уход.

  1. Мойте локоны теплой водой с использованием специального шампуня для окрашенных.
  2. После каждого мытья наносите кондиционер, уделяя особое внимание кончикам.
  3. Сушите феном не постоянно, а несколько раз в недел.
  4. Для расчесывания используйте расчески и щетки с натуральным ворсом, либо деревянные.
  5. Для укладки рекомендовано использовать фен, а не плойку и щипцы.
  6. Отдавайте предпочтение моделирующей пасте или воску, а не гелю.
  7. Обзаведитесь питательными средствами, предназначенными для ухода за окрашенными локонами.
  8. Берегите голову от активного воздействия солнечных лучей.

Тонирование от желтизны для светлых волос

Тонирование – процесс окрашивания в ходе которого на локоны наносится красящий состав с нулевым содержанием аммиака. Тонирование позволяет придать более насыщенный оттенок или изменить природный цвет на несколько тонов.

Сохранить яркий и насыщенный белый цвет без желтизны, блондинкам помогут специальные “серебряные” шампуни. В их состав входит особый пигмент, который позволяет надолго нейтрализовать желтизну. При систематическом использовании гарантирован длительный эффект.

Тонирование от рыжины для темных локонов

Рыжина на темных волосах может появиться вследствие попытки провести обесцвечивание окрашенной базы или же при переходе в русый цвет. Избавиться от проявления рыжего цвета на темной шевелюре поможет красящий состав сине-зеленого или синего цвета.

Какой шампунь выбрать

Правильный подход к выбору шампуня для ухода за окрашенными локонами позволит восстановить и сохранить их красоту и силу. Широкий ассортимент шампуней в специализированных магазинах позволит каждой подобрать наиболее подходящий вариант. Рекомендуем вам обратить внимание на следующие продукты:

  • шампунь для окрашенных и тонких волос Brilliance от Wella
  • BlondMe Shampoo for Warm – шампунь, который подойдет в случае, если нужно поддержать теплые тона
  • Color Care из серии Caring Line прекрасно подойдет для ухода за окрашенными волосами

 

Маски для осветленных и окрашенных волос

В дополнение к шампуню можно делать специальные восстанавливающие маски из доступных продуктов.

На основе авокадо
Для приготовления понадобиться:

  • 1 банан
  • 1 авокадо
  • 30 мл оливкового масла

Смешайте все составляющие при помощи погружного блендера. Нанесите состав по всей длине волос, наденьте целлофановый пакет и укутайте волосы махровым полотенцем. Оставьте смесь на 1 час, а после тщательно вымойте волосы теплой водой с использованием шампуня.

Стимулирующая
Для приготовления понадобиться:

  • желтки яиц (от 1 до 3-х, в зависимости от густоты и длины волос)

Взбейте их в пену и распределите по чистым и влажным волосам, накройте целлофановым пакетом на 5-10 минут, после ополосните теплой водой.

На основе кефира
Для приготовления понадобиться:

  • 4 ст.л. кефира с большим процентом жирности
  • 1 ст.л. меда
  • желток одного яйца

Смешайте все компоненты и нанесите по всей длине волос. Оставьте состав на 40 минут, после смойте под струей теплой воды. Маска поможет обеспечить интенсивное увлажнение пересушенным окрашенным волосам.

Не бойтесь экспериментировать и менять цвет своих волос и свой образ. Но не пренебрегайте правильным уходом за окрашенными волосами. Гармоничное сочетание подходящего шампуня и систематическое нанесение домашних масок позволит надолго сохранить результат вашего перевоплощения, а вам оставаться модной красоткой!

PhaseStain: цифровое окрашивание изображений количественной фазовой микроскопии без меток с использованием глубокого обучения

Подготовка образцов и визуализация

Все образцы, которые использовались в этом исследовании, были получены из основной лаборатории трансляционной патологии (TPCL) и подготовлены отделом гистологии Лаборатория в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Они были получены после деидентификации информации о пациенте и подготовлены на основе существующих образцов. Таким образом, эта работа не противоречила стандартной практике ухода или процедур сбора образцов.

После заливки в парафин, фиксирующего формалин, тканевый блок делится с помощью микротома на срезы толщиной ~ 2–4 мкм. Этот шаг необходим только на этапе обучения, когда преобразование фазового изображения в изображение светлого поля должно быть изучено статистически. Затем эти тканевые срезы депарафинизируют с использованием ксилола и помещают на стандартное предметное стекло с использованием CytosealTM (Thermo-Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с последующим запечатыванием образца покровным стеклом.В процессе обучения / обучения этот этап запечатывания дает несколько преимуществ: защита образца во время визуализации и обработки образцов и уменьшение артефактов, таких как колебания толщины образца.

После подготовки образца изображение образца было визуализировано с помощью встроенного в чип голографического микроскопа для получения количественного фазового изображения (подробное описание приведено в следующем подразделе). После процесса QPI предметные стекла без этикеток помещали в ксилол на ~ 48 ч, пока покровное стекло не могло быть удалено без искажения ткани.После удаления покровного стекла его несколько раз окунули в абсолютный спирт и 95% спирт, а затем промыли в D.I. вода в течение ~ 1 мин. После этого этапа предметные стекла окрашивали H&E (кожная ткань), красителем Джонса (ткань почек) и трихромом Массона (ткань печени), а затем закрывали покровные стекла. Затем эти образцы ткани были визуализированы с помощью автоматического слайд-сканирующего микроскопа светлого поля (Aperio AT, Leica Biosystems) с объективом 20 × / 0,75NA (Plan Apo), оснащенного адаптером увеличения 2 ×, что дает эффективный размер пикселя ~ 0.25 мкм.

Количественная фазовая визуализация

Установка безлинзовой визуализации

Количественные фазовые изображения образцов ткани без этикеток были получены с использованием установки для голографии без линз 41 . В качестве источника освещения использовался источник света (WhiteLase Micro, NKT Photonics, Дания) с центральной длиной волны 550 нм и спектральной шириной полосы ~ 2,5 нм. Неколлимированный свет, излучаемый одномодовым волокном, использовался для создания квазиплоской волны, освещающей образец.Образец помещался между источником света и чипом датчика изображения CMOS (IMX 081, Sony Corp., Минато, Токио, Япония, размер пикселя 1,12 мкм) с расстоянием от источника до образца ( z 1 ). 5–10 см и расстояние от образца до датчика ( z 2 ) 1–2 мм. Этот голографический микроскоп без линз на кристалле имеет субмикронное разрешение с эффективным размером пикселя 0,37 мкм, охватывая образец FOV ~ 20 мм 2 (что составляет всю активную область датчика).Ступень позиционирования (MAX606, Thorlabs Inc., Ньютон, штат Нью-Джерси, США), на которой находился датчик CMOS, позволила выполнить трехмерное преобразование микросхемы имидж-сканера для выполнения пиксельного сверхвысокого разрешения (PSR) 5,41,42 и multiheight- на основе итеративного восстановления фазы 41,43 . Все оборудование для обработки изображений автоматически контролировалось LabVIEW (National Instruments Corp., Остин, Техас, США).

Метод пиксельного сверхвысокого разрешения (PSR)

Для синтеза голограммы высокого разрешения (с размером пикселя ~ 0.37 мкм), используя только канал G1 шаблона Байера (R, G1, G2 и B), был применен алгоритм PSR на основе сдвига и сложения 42,44 . Стадия трансляции, на которой находится датчик изображения, была запрограммирована на сдвиг в поперечном направлении на сетке 6 × 6 с интервалом между субпикселями на каждом расстоянии от образца до датчика. Голограмма с низким разрешением была записана в каждой позиции, и поперечные смещения были точно оценены с использованием алгоритма оценки смещения 41 . Результатом этого шага является шесть неперекрывающихся панелей, каждая из которых была дополнена до размера 4096 × 4096 пикселей и индивидуально восстановлена ​​по фазе, что подробно описано ниже.

Многовысотное восстановление фазы

Были сняты поточные голограммы без линз на восьми расстояниях от образца до сенсора. Размер шага осевого сканирования был выбран равным 15 мкм. Точные шаги z были получены путем применения алгоритма голографической автофокусировки на основе критерия разреженности краев («Тамура градиента», то есть ToG) 45 . Нулевая фаза была назначена измерению интенсивности объекта в качестве начального предположения фазы для начала итераций. Затем использовался итерационный алгоритм восстановления фазы с несколькими высотами , 46, путем распространения комплексного поля вперед и назад между каждой высотой с использованием передаточной функции свободного пространства 47 .Во время этого итеративного процесса фаза оставалась неизменной в каждой осевой плоскости, а амплитуда обновлялась с использованием квадратного корня из измерения интенсивности объекта. Одна итерация была определена как распространение голограммы с восьмой высоты (наиболее удаленной от сенсорного чипа) до первой высоты (ближайшей к датчику) с последующим обратным распространением комплексного поля до восьмой высоты. Обычно фаза восстанавливается после 10–30 итераций. На заключительном этапе реконструкции комплексная волна, определяемая сведенными амплитудой и фазой в данной плоскости голограммы, распространялась на плоскость объекта 47 , из которой была извлечена фазовая составляющая образца.

Предварительная обработка данных и регистрация изображений

Важным этапом в нашем процессе обучения является выполнение точной регистрации изображения между двумя модальностями визуализации (QPI и светлое поле), что включает этапы как глобального сопоставления, так и локального выравнивания. Так как сеть нацелена на изучение преобразования от изображения, полученного без меток, полученного по фазе, в изображение с гистологически окрашенным светлым полем, очень важно точно выровнять FOV для каждой пары входного и целевого изображений в наборе данных.Мы выполняем эту процедуру согласования кросс-модальности в четыре этапа; шаги 1, 2 и 4 выполняются в MATLAB (The MathWorks Inc., Натик, Массачусетс, США), а шаг 3 включает TensorFlow.

Первый шаг — найти примерно совпадающий FOV между QPI и соответствующим изображением светлого поля. Это делается путем первого бикубического понижения дискретизации всего изображения слайда (WSI) (~ 60 на 60 тыс. Пикселей), чтобы соответствовать размеру пикселя изображения, полученного по фазе. Затем каждое фазовое изображение размером 4096 × 4096 пикселей было обрезано на 256 пикселей с каждой стороны (в результате получилось изображение с размером 3584 × 3584 пикселей), чтобы удалить заполнение, которое используется для процесса восстановления изображения.После этого шага как светлое поле, так и соответствующие фазовые изображения извлекаются по краям с использованием метода Кэнни 48, , который использует двойной порог для обнаружения сильных и слабых краев на градиенте изображения. Затем вычисляется матрица оценок корреляции путем корреляции каждого фрагмента размером 3584 × 3584 пикселей результирующего краевого изображения с тем же размером, что и изображение, извлеченное из краевого изображения светлого поля. Изображение с наивысшим показателем корреляции указывает на совпадение между двумя изображениями, и соответствующее изображение светлого поля вырезается из WSI.После этой процедуры первоначального согласования количественное фазовое изображение и изображения, полученные с помощью светлопольного микроскопа, грубо согласовываются.

Второй этап используется для корректировки возможных поворотов между этими грубо согласованными парами изображений, которые могут быть вызваны небольшим несоответствием в размещении образца во время двух экспериментов по получению изображений (которые выполняются на разных системах формирования изображений, голографических или светлых полях). ). Этот шаг регистрации на основе интенсивности коррелирует пространственные шаблоны между двумя изображениями; фазовое изображение, которое преобразовано в формат целого числа без знака, и компонент яркости изображения светлого поля использовались для этой мультимодальной структуры регистрации, реализованной в MATLAB.Результатом этой цифровой процедуры является матрица аффинного преобразования, которая применяется к фрагменту изображения светлопольного микроскопа, чтобы сопоставить его с количественным фазовым изображением того же образца. После этого шага регистрации фазовое изображение и соответствующее изображение светлого поля глобально совмещаются. Дополнительная обрезка по 64 пикселя с каждой стороны для выровненных пар изображений используется для корректировки возможного угла поворота.

Третий этап включает обучение отдельной нейронной сети, которая примерно обучается преобразованию количественных фазовых изображений в окрашенные изображения светлого поля, что может помочь в коррекции искажений между двумя модальностями изображения на четвертом / последнем этапе.Другими словами, чтобы сделать локальную регистрацию управляемой, мы сначала обучаем глубокую сеть с глобально зарегистрированными изображениями, чтобы уменьшить энтропию между изображениями, полученными с помощью двух методов визуализации (то есть QPI по сравнению с изображением окрашенной ткани в светлом поле). Эта нейронная сеть имеет ту же структуру, что и сеть, которая использовалась для окончательного процесса обучения (см. Следующий подраздел об архитектуре GAN и ее обучении) с входными и целевыми изображениями, полученными на втором этапе регистрации, о котором говорилось ранее.Поскольку пары изображений еще недостаточно хорошо выровнены, обучение останавливается на раннем этапе только на ~ 2000 итерациях, чтобы избежать структурных изменений на выходе, которые должны быть изучены сетью. Выходные и целевые изображения сети затем используются в качестве пар регистрации на четвертом этапе, который представляет собой алгоритм регистрации эластичного изображения, используемый для корректировки регистрации локальных признаков 16 .

Архитектура и обучение GAN

Архитектура GAN, которую мы использовали для PhaseStain, подробно описана на рис.6 и дополнительная таблица 1. После регистрации количественных фазовых изображений без меток с изображениями светлого поля гистологически окрашенных срезов ткани эти точно выровненные поля зрения были разделены на перекрывающиеся участки размером 256 × 256 пикселей, которые затем были используется для обучения модели GAN. GAN состоит из двух глубоких нейронных сетей, генератора и дискриминатора. Функция потерь дискриминаторной сети определяется выражением:

$$ \ ell _ {{\ mathrm {discnator}}} = D (G (x _ {{\ mathrm {input}}})) ^ 2 + (1 — D ( z _ {{\ mathrm {label}}})) ^ 2 $$

(3)

где D (.) и G (.) относятся к операторам дискриминатора и генератора, соответственно, x вход обозначает вход генератора, который представляет собой количественное фазовое изображение без меток, а z метка обозначает светлопольное изображение гистологически окрашенной ткани. Сеть генератора, G , пытается сгенерировать выходное изображение с теми же статистическими характеристиками, что и метка z , в то время как дискриминатор, D , пытается различить целевое изображение и выходное изображение генератора.Идеальный результат (или состояние равновесия) будет, когда выходные изображения генератора и целевые изображения имеют одинаковое статистическое распределение, где в этом случае D ( G ( x входной )) должно сходиться к 0,5. Для глубокой сети генератора мы определили функцию потерь как:

$$ \ ell _ {{\ mathrm {generator}}} = L_1 \ left \ {{z _ {{\ mathrm {label}}}, G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right \} + \ lambda \\ \ times {\ mathrm {TV}} \ left \ {{G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right \} + \ alpha \ times \ left ({1 — D \ left ({G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right)} \ right) ^ 2 $$

(4)

, где L 1 {.} термин относится к абсолютной попиксельной разнице между выходным изображением генератора и его целевым изображением, TV {.} означает регуляризацию общей вариации, которая применяется к выходному сигналу генератора, а последний член отражает штраф, связанный с к предсказанию дискриминаторной сети выхода генератора. Параметры регуляризации ( λ , α ) были установлены на 0,02 и 2000, так что общий член потерь вариации, λ × TV { G ( x вход )}, составлял ~ 2 % от потери L 1 и члена потери дискриминатора α × (1 — D ( G ( x вход ))) 2 составлял ~ 98% от общие потери генератора, л, , генератор , .

Фиг.6

Архитектура сетей генератора и дискриминатора в рамках GAN

Для генерации глубокой нейронной сети мы адаптировали архитектуру U-net 49 , которая состоит из тракта понижающей и повышающей дискретизации, причем каждый путь содержит четыре блока, образующих четыре различных уровня (см. Рис. 6 и дополнительную таблицу 1). . В тракте понижающей дискретизации каждый остаточный блок состоит из трех сверточных слоев и трех блоков линейного выпрямления с утечкой (LReLU), используемых в качестве функции активации, которая определяется как:

$$ {\ mathrm {LReLU}} (x) = \ left \ {{\ begin {array} {* {20} {c}} x & {{\ mathrm {for}} \; x> 0} \\ {0.1x} & {{\ mathrm {else}}} \ end {array}} \ right. $$

(5)

На выходе каждого блока количество каналов увеличивается в 2 раза (за исключением первого блока, который увеличивается с 1 входного канала до 64 каналов). Блоки соединены слоем объединения среднего шага два, который понижает дискретизацию выходного сигнала предыдущего блока в два раза как для горизонтального, так и для вертикального измерения (как показано на рисунке 6 и в дополнительной таблице 1).

В канале повышающей дискретизации каждый блок также состоит из трех сверточных слоев и трех функций активации LReLU, которые уменьшают количество каналов на его выходе в четыре раза. Блоки соединены билинейным слоем повышающей дискретизации, который увеличивает размер выходных данных предыдущего блока в два раза для обоих боковых размеров. Функция конкатенации с соответствующей картой характеристик из тракта понижающей дискретизации того же уровня используется для увеличения количества каналов на выходе предыдущего блока на два.Два пути соединены на первом уровне сети сверточным слоем, который поддерживает количество карт характеристик из выходных данных последнего остаточного блока в пути понижающей дискретизации (см. Рисунок 6 и дополнительную таблицу 1). Последний слой представляет собой сверточный слой, который отображает выходные данные пути повышающей дискретизации в 3 канала цветовой карты YCbCr.

Дискриминаторная сеть состоит из одного сверточного слоя, пяти блоков дискриминатора, слоя среднего пула и двух полностью связанных слоев.Первый сверточный слой получает 3 канала (цветовую карту YCbCr) либо от выхода генератора, либо от цели и увеличивает количество каналов до 64. Блоки дискриминатора состоят из двух сверточных слоев, причем первый слой поддерживает размер карты признаков, а количество каналов, а второй слой увеличивает количество каналов в два раза и уменьшает размер карты функций в четыре раза. Слой объединения средних значений имеет размер фильтра 8 × 8, что приводит к матрице с размером ( B, , 2048), где B, относится к размеру пакета.Выходные данные этого слоя с объединением средних значений затем передаются в два полностью связанных слоя, причем первый слой сохраняет размер карты признаков, а второй уровень уменьшает выходной канал до 1, в результате чего выходной размер составляет ( B , 1). Выход этого полностью связанного слоя проходит через сигмовидную функцию, указывающую на вероятность того, что вход трехканального дискриминатора получен из гистологически окрашенного изображения светлого поля. Для дискриминаторной сети все сверточные слои и полносвязные слои связаны функциями нелинейной активации LReLU.

На протяжении всего обучения размер фильтра свертки был установлен равным 3 × 3. Для генерации фрагментов мы применили увеличение данных, используя перекрытие фрагментов 50% для изображений ткани печени и кожи и 25% перекрытия фрагментов для ткани почек. изображения (см. Таблицу 1). Обучаемые параметры, включая фильтры, веса и смещения в сверточных слоях и полностью связанных слоях, обновляются с помощью оптимизатора оценки адаптивного момента (Adam) со скоростью обучения 1 × 10 — 4 для сети генератора и 1 × 10. −5 для дискриминаторной сети.

Таблица 1 Детали обучения виртуальному окрашиванию различных типов тканей с помощью PhaseStain. После обучения слепой вывод занимает ~ 0,617 с для поля зрения ~ 0,45 мм 2 , что соответствует ~ 3,22 мегапикселя (см. Раздел «Обсуждение»)

Для каждой итерации дискриминатора было против итераций генераторная сеть; для тренировки ткани печени и кожи v = max (5, этаж (7 — w /2)), где мы увеличивали w на 1 на каждые 500 итераций ( w было инициализировано как 0).Для тренировки почечной ткани мы использовали v = max (4, этаж (6 — w /2)), где мы увеличивали w на 1 на каждые 400 итераций. Это помогло нам научить дискриминатор не подгонять под целевые изображения светлого поля. Мы использовали партии размером десять для тренировки срезов ткани печени и кожи и пять для срезов ткани почек. Все записи сверточного ядра инициализируются с использованием усеченного нормального распределения. Все члены смещения сети инициализируются равными нулю.Обучение сети остановилось, когда потери набора проверки L 1 не уменьшились после 4000 итераций. Типичный график сходимости нашей тренировки показан на рис. 7.

Рис. 7: Графики сходимости PhaseStain для набора проверки цифрового окрашивания H&E кожной ткани .

a L 1-потеря по количеству итераций. b Потери генератора, l генератор в зависимости от количества итераций

Детали реализации

Количество фрагментов изображения, которые использовались для обучения, количество эпох и расписания обучения показаны в таблице 1 .Сеть была реализована с использованием Python версии 3.5.0 и фреймворка TensorFlow версии 1.7.0. Мы реализовали программное обеспечение на настольном компьютере с процессором Core i7-7700K @ 4,2 ГГц (Intel Corp., Санта-Клара, Калифорния, США) и 64 ГБ ОЗУ, работающим под управлением операционной системы Windows 10 (Microsoft Corp., Редмонд, Вашингтон, США). СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). После обучения для каждого среза ткани соответствующая сеть была протестирована с 4 фрагментами изображения размером 1792 × 1792 пикселей с перекрытием ~ 7%. Затем выходные данные сети были сшиты, чтобы сформировать окончательное выходное изображение сети размером 3456 × 3456 пикселей (FOV ~ 1.7 мм 2 ), как показано, например, на рис. 2. Обучение и тестирование сети проводились с использованием двух графических процессоров GeForce GTX 1080Ti (NVidia Corp., Санта-Клара, Калифорния, США).

Армстронг Кларк Фотоальбом и фотографии морилки

Потолок Armstrong Clark Natural Tone с коричневой отделкой в ​​деревенском стиле

Armstrong Clark Натуральный потолок из кедра

Деревянная дверь Armstrong Clark Natural Tone

Забор Armstrong Clark Natural Tone

Armstrong Clark Natural Tone Ralings

Armstrong Clark Deck Stairs Natural Tone

Напольное покрытие Armstrong Clark Natural Tone

Забор Armstrong Clark Cedar Tone

Забор Armstrong Clark Cedar Tone

Деревянный дом Armstrong Clark Cedar Tone

Armstrong Clark Cedar Tone Stairs and House

Армстронг Clark Cedar Tone Cedar Home

Дека Armstrong Clark Cedar Tone

Дека Armstrong Clark Cedar Tone

Дека Armstrong Clark Cedar Tone

Дека Armstrong Clark Cedar Tone —

Армстронг Кларк Редвуд Tone House

Дека Armstrong Clark Redwood Tone

Дека Armstrong Clark Redwood Tone

Дека Armstrong Clark Redwood Tone

Armstrong Clark Redwood Tone Гаражная дверь

Дом у озера Армстронг Кларк Редвуд Тон

Полупрозрачная дека Armstrong Clark из кедра на прозрачном красном дереве

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на заборе и террасе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на заборе и террасе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный кедр Armstrong Clark на доке

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на заборе

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на заборе

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр для дома

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр для дома

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на бревенчатом доме

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на бревенчатом доме

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на бревенчатом доме

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на бревенчатом доме

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на бревенчатом доме

Armstrong Clark Полупрозрачный кедр на кедре Home

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на палубе

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на палубе

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на заборе

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на столе для пикника

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на палубе

Armstrong Clark Дуб натуральный полупрозрачный на палубе

Armstrong Clark Полупрозрачный рустик-коричневый на палубе

Armstrong Clark Полупрозрачный рустикальный коричневый на полу

Armstrong Clark Полупрозрачный рустик коричневый на заборе

Armstrong Clark Полупрозрачный рустик коричневый на заборе

Armstrong Clark Полупрозрачный рустикальный коричневый на отделке

Армстронг Кларк Полупрозрачный деревенский коричневый дом

Armstrong Clark Полупрозрачный рустик-коричневый на палубе

Armstrong Clark Semi-Transparent Driftwood Grey на палубе

Armstrong Clark Semi-Transparent Driftwood Grey на палубе

Полупрозрачный плавник Armstrong Clark серый на коробке

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на столе

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на полу

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на палубе

Полупрозрачный каштан Armstrong Clark на лестнице

Armstrong Clark Semi-Transparent Sierra Redwood на палубе

Armstrong Clark Semi-Transparent Sierra Redwood на двери

Armstrong Clark Semi-Transparent Sierra Redwood на доме

Armstrong Clark Hardwood, янтарный цвет на тике

Armstrong Clark Hardwood Color Amber на дверях

Armstrong Clark Hardwood Color Amber по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Amber по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Amber по IPE

Армстронг Кларк Эмбер на кедровом заборе

Armstrong Clark Hardwood Color Mahogany по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Mahogany по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Mahogany по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Mahogany по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Mahogany по IPE

Armstrong Clark Hardwood Color Черный орех по IPE

Armstrong Clark Black Walnut на палубе

Armstrong Clark Полупрозрачный черный орех с отделкой

Полупрозрачный орех Armstrong Clark на ставнях

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Полутвердый горный кедр Armstrong Clark на палубе

Армстронг Кларк Полутвердое дерево Коричневый на палубе

Армстронг Кларк Полутвердое дерево Коричневый на заборе

Армстронг Кларк Полутвердое дерево Коричневый на заборе

Армстронг Кларк Полутвердое дерево Коричневый на ступеньках

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на заборе

Armstrong Clark Полутвердые секвойи на заборе

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на заборе

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на доме

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на палубе

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на палубе

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на палубе

Армстронг Кларк Полутвердые секвойи на палубе

Armstrong Clark Semi-Solid Oxford Brown на навесе

Armstrong Clark Полутвердый оксфорд коричневый на выступе

Armstrong Clark Semi-Solid Oxford Brown на палубе

Предсказание микрососудов на изображениях патологий, окрашенных H&E, с использованием полностью сверточных нейронных сетей | BMC Bioinformatics

В этой статье все результаты были получены в компьютерном эксперименте с использованием интерфейса Python 3.0 на основе фреймворка глубокого обучения Caffe [51], который был установлен и запущен на сервере с Linux версии 3.16.0-69-generic и Ubuntu 4.8.2-19 в 64-битной версии. Этот сервер также включает в себя два процессора Intel (R) Xeon (R) CPU E5-2680 v3 с тактовой частотой 2,50 ГГц и 30 МБ кэш-памяти, при этом каждый процессор имеет 12 ядер, а общее количество логических ядер ЦП составляет 48. Сервер имеет 132 ГБ ОЗУ и графический процессор NVIDIA Tesla K40 m с 2880 потоковыми ядрами, максимальным объемом памяти 12 ГБ, максимальной пропускной способностью памяти 288 ГБ / с и тактовой частотой памяти 6 ГГц.

Гистологические изображения, окрашенные H&E для пациентов с аденокарциномой легкого (ADC), были получены из Национального онкологического центра / онкологической больницы, CHCAMS и Пекинского медицинского колледжа Союза, Китай. Эти изображения слайдов были при 20-кратном увеличении с разрешением 0,5 мкм / пиксель. 300 изображений размером 384 × 384 (пикселей) были извлечены из 10 изображений патологических слайдов, окрашенных H&E, и использовались для обучения алгоритму. Еще 50 изображений размером 384 × 384 (пикселей) были извлечены из 5 новых слайдов и использованы в качестве набора данных для проверки.Чтобы повысить точность маркированных вручную микрососудов, у нас были два патологоанатома, доктора. Лэй Го и Линь Ян независимо маркируют кровеносные сосуды и использовали кровеносные сосуды, которые оба патолога согласились с основной истиной для оценки эффективности алгоритмов (общее согласие между двумя патологами составило около 85%). Пиксели внутри микрососудов были помечены как передний план (со значением, равным 1), в то время как другие области были обозначены как 0 с. Все эти маркированные микрососуды были проверены и согласованы с другим патологоанатомом.Два типичных изображения окрашенных H&E с помеченными микрососудами показаны на рис. 3. Наконец, 35 больших изображений размером 1600 × 1600 (пикселей) были извлечены из 5 новых изображений слайдов патологии, окрашенных H&E, и использованы в качестве тестовых изображений для оценки эффективности. Стратегия обучения, тестирования и оценки представлена ​​на рис. 4.

Рис. 3

Иллюстрация двух изображений, окрашенных H&E, с помеченными микрососудами. a и b два изображения, окрашенных H&E. c и d соответствующие маски микрососудов изображений в ( a ) и ( b )

Рис. 4

Блок-схема стратегии обучения, тестирования и оценки

Структура FCN была разработана с использованием Caffe [51] и проводится на графическом процессоре. Некоторые уровни структуры FCN из этого исследования аналогичны таковым в сетях VGG-16 [52], а некоторые — нет. Параметры слоев этой сети, которые были такими же, как сети VGG-16, были инициированы из предварительно обученной модели VGG-16 Caffe, в то время как параметры в уровнях, которые отличались от сетей VGG-16, были инициализированы с помощью алгоритма Ксавьера. [53].Затем эта сеть FCN была настроена с использованием обучающих изображений, в то время как размер min-batch был установлен равным 5. Для обучения FCN был применен алгоритм стохастического градиентного спуска для оптимизации функции потерь с целью точной настройки FCN. модель. Значение импульса было задано как 0,99, а спад веса, который используется для регуляризации функции потерь, был установлен как 0,0005. Далее скорость обучения была инициализирована равной 0,01 и уменьшалась в 10 раз каждые 1000 итераций.

Значения потерь во время фазы обучения FCN на основе наборов данных обучения и проверки измеряются и показаны на рис.5. Как показано на рис. 5, были небольшие колебания значений потерь в наборе обучающих данных, и они имели тенденцию быть более стабильными, когда число итераций приближалось к 6000. Это указывало на то, что структура FCN изучила особенности микрососудов. Некоторые карты функций и изученные параметры представлены на рис. 6 (a) — (d). Из фиг. 6 (h) видно, что области микрососудов имеют сильно отличающуюся информацию от областей немикрососудов. После фазы обучения обученная модель FCN затем использовалась для обнаружения микрососудов на новых входных изображениях, окрашенных H&E.Некоторые результаты обнаружения модели FCN показаны на рис. 6 (e) — (i). Это показывает, что большинство микрососудов было успешно обнаружено.

Рис. 5

Значения потерь во время обучения FCN

Рис. 6

Иллюстрация карт характеристик и результатов прогнозирования заученных весов. a Изображение, окрашенное H&E. b Карты некоторых объектов в сверточном слое. c Некоторые изученные веса в сверточном слое. d Одна карта объектов в слое деконволюции. e h : оригинальные изображения, окрашенные H&E. i l Соответствующие результаты обнаружения микрососудов от обученной модели FCN

Кроме того, результаты сегментации микрососудов были количественно измерены на основе 50 тестовых изображений размером 384 × 384 пикселей, окрашенных H&E, которые не использовались на этапе обучения FCN. Для оценки сегментации были приняты показатели, состоящие из точности пикселей (pA), средней точности (мА) и среднего пересечения по объединению (mIU).Эти показатели были определены следующим образом:

$$ pA = {\ sum} _i {n} _ {ii} / {\ sum} _i {t} _i $$

(2)

$$ mA = \ left (\ frac {1} {n_ {cl}} \ right) {\ sum} _i {n} _ {ii} / {t} _i $$

(3)

$$ mIU = \ left (1 / {n} _ {cl} \ right) \ {\ sum} _i {n} _ {ii} / \ left ({t} _i + {\ sum} _j {n} _ {ji} — {n} _ {ii} \ right) $$

(4)

где n ij
— это количество пикселей класса i , которые, по прогнозам, принадлежат классу j , n cl
— общее количество разных классов, а т i
= ∑ j
n ij
— это общее количество пикселей класса и .В дополнение к вышеупомянутым показателям для оценки сегментации использовалось количество ложноположительных (FP) и ложноотрицательных (FN) результатов. FP относится к количеству предсказанных микрососудов, которые на самом деле не были микрососудами, а FN означает количество микрососудов, которые не были успешно обнаружены. В общей сложности 35 изображений патологии размером 1600 × 1600 были извлечены из еще 5 слайдов, окрашенных H&E, которые не использовались на этапе обучения и тестирования FCN (см. Рис. 4). Обученный FCN был применен к этим новым 35 изображениям, чтобы оценить FP и FN.Общее количество микрососудов на этих изображениях было около 450. В этом исследовании модель FCN-8 s, предложенная в [34], также применялась для обнаружения микрососудов и использовалась для сравнения. Результаты оценки прогнозов как нашей модели FCN, так и FCN-8 показаны в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что предложенная модель FCN превосходит FNC-8 по всем определенным показателям. Патолог проверил FP и обнаружил, что две модели, похоже, неправильно классифицируют области, имеющие клетки крови, как микрососуды, но на самом деле появление клеток крови не гарантирует наличия микрососудов.Ожидается, что проблема FP может быть уменьшена с помощью большего количества обучающих изображений, которые содержат больше областей, не связанных с микрососудом, с некоторыми клетками крови.

Таблица 1 Результаты прогнозирования между нашими FCN и FCN-8 s

В дополнение к вышеупомянутым метрикам, время обучения и время прогнозирования / вывода были измерены и сравнены между нашей моделью FCN и FCN-8 s в таблице 2. Это указывает на то, что что предлагаемая модель FCN требует меньше времени вывода, чем FCN-8 с в [34], при этом требуется больше времени на обучение.

Таблица 2 Затраты времени между нашим FCN и FCN-8 с

Поскольку сложно собрать большое количество помеченных изображений для обучения FCN с нуля, точная настройка сетей является хорошей стратегией с использованием ограниченного количества обучающих изображений . В целом предлагаемая модель FCN имеет меньше слоев, чем модель, используемая в FCN-8, и хорошо использует ограниченные обучающие образы и приводит к меньшему времени вывода. Однако еще один слой слияния, используемый в нашей модели, может усложнить обратное распространение и потребовать более длительного времени обучения.Уровень прогнозирования в FCN-8 s подвергается повышающей дискретизации в 8 раз по сравнению с предыдущим уровнем, и он дает более грубые результаты по сравнению с таковым в нашей модели FCN, где результат прогнозирования только в 2 раза повышается по сравнению с предыдущими уровнями и, таким образом, может повысить точность. Также ожидается, что точность прогнозирования для обеих моделей FCN может быть улучшена, если будет предоставлено больше обучающих изображений.

В этом исследовании мы применили обученную модель FCN для идентификации микрососудов на изображениях патологии 88 пациентов с аденокарциномой легких из когорты CHCAMS.Сначала патолог по раку легких идентифицировал и пометил области опухоли на каждом слайде ткани в согласии с другим патологом, а затем мы случайным образом отобрали три репрезентативных изображения из каждой области опухоли. Общее количество собранных образцов изображений составило 274. Для каждого образца изображения мы идентифицировали микрососуды с помощью модели FCN. Затем мы рассчитали общую площадь микрососудов на каждом изображении, а также процент опухолевых клеток вокруг микрососудов, определяемый числом опухолевых клеток вокруг микрососудов, деленным на общее количество клеток вокруг микрососудов.

С расчетной общей площадью микрососудов и процентом опухолевых клеток вокруг микрососудов мы подобрали регрессионную модель Кокса для оценки связи между предполагаемыми характеристиками микрососудов и результатами выживаемости пациентов после корректировки другой клинической информации, такой как возраст, пол, и табачная история. Множественные образцы изображений от одного и того же пациента были смоделированы как коррелированные наблюдения в регрессионной модели Кокса, чтобы вычислить устойчивую дисперсию для каждого коэффициента. Отношение рисков (HR), 95% доверительный интервал (CI) HR и значение p для каждой переменной приведены в таблице 3.

Таблица 3 Анализ выживаемости для изображений патологии рака легкого NLST

Результаты показывают, что более высокая плотность микрососудов у пациента связана со значительно лучшим результатом выживания. Это открытие согласуется с текущими исследованиями рака легких [3] и рака почки [54]. Кроме того, более высокий процент опухолевых клеток вокруг микрососудов связан с плохим результатом выживания, но значение p имеет лишь незначительное значение, вероятно, из-за ограниченного размера выборки ( n = 88).

Кроме того, мы применили разработанный алгоритм к другим типам исследований H&E. Некоторые результаты прогнозирования микрососудов, основанные на изображениях, окрашенных H и E при раке груди и почек, показаны на рис. 7. Текущий алгоритм, кажется, достаточно хорошо работает для изображений, окрашенных H и E при различных типах рака. Однако для дальнейшего изучения необходима систематическая оценка.

Рис.7 Результаты прогнозирования микрососудов

на изображении, окрашенном H и E, при раке груди ( a ) и ( b ) и раке почки ( c ) и ( d )

Простая микробиология без бактериальных пятен Изображения и фотографии

Библиотека научных изображений: простые бактериальные пятна

Библиотека научных изображений

Простые пятна бактерий

из Интернета Bacillus subtilis Фотографии простых пятен (Щелкните изображение, чтобы увеличить.)

У вас есть бесплатный доступ к большой коллекции материалов, используемых во вводном курсе микробиологии на уровне колледжа. Виртуальный класс микробиологии предоставляет широкий спектр бесплатных образовательных ресурсов, включая лекции в PowerPoint, учебные руководства, контрольные вопросы и практические контрольные вопросы.

Staphylococcus epidermidis , окрашенный кристаллическим фиолетовым при 1000xTM.

1. Bacillus subtilis , окрашенный кристаллическим фиолетовым @ 100xTM. Невозможно увидеть отдельные бактерии при таком увеличении, но просмотр при 100-кратном увеличении является необходимым шагом в фокусировке на телескоп, чтобы видеть при более высоком увеличении.2. Bacillus subtilis , окрашенный кристаллическим фиолетовым при 1000xTM. Обратите внимание на большое количество эндоспор.

E. coli Фотографии простых пятен (Щелкните изображение, чтобы увеличить.)

Staphylococcus Фотографии простых пятен (Щелкните изображение, чтобы увеличить.)

1. E coli , окрашенная кристаллическим фиолетовым @ 100xTM. Невозможно увидеть отдельные бактерии при таком увеличении, но просмотр при 100-кратном увеличении является необходимым шагом в фокусировке на телескоп, чтобы видеть при более высоком увеличении.2. E. coli , окрашенная кристаллическим фиолетовым при 1000xTM.

SPO — это БЕСПЛАТНЫЙ веб-сайт по естественно-научному образованию. Пожертвования — это ключ к тому, чтобы мы могли показывать на этом ресурсе меньше рекламы.

Пожалуйста, помогите!

(Эта ссылка для пожертвований использует PayPal для безопасного соединения.)

Библиотека микробиологических изображений — это самая большая коллекция фотографий на сайте SPO. Чтобы вам было проще найти то, что вы ищете, выберите ссылку «Подробнее» в подтеме ниже, которая соответствует вашим интересам, или воспользуйтесь окнами поиска.
Библиотека научных изображений SPO — это постоянно пополняющаяся коллекция научных фотографий, не защищенных авторскими правами. Если вы используете одно из наших бесплатных изображений с низким разрешением, мы просто просим вас предоставить нам кредит и ссылку на веб-сайт SPO (scienceprofonline.com). Нажмите на фото для увеличения. Чтобы сохранить фотографию на свой компьютер, щелкните ее правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить».
Для тех, кто нуждается в изображениях с высоким разрешением, мы скоро предложим файлы в высоком разрешении со многими фотографиями в Библиотеке изображений для науки. Подпишитесь на нас в Twitter @ScienceProfSPO, чтобы получать обновления о новых функциях и продуктах SPO.Если вам сейчас нужна фотография с высоким разрешением, свяжитесь с нами.

Не нашли то, что вам нужно?

Поиск SPO для фотографии

Фотошаблоны для дифференциальных пятен

уже в продаже!

Ресурсы биологического окрашивания клеток

Как создать текстуру, окрашенную кофе, для состаривания изображений в Photoshop

В детстве я помню, как на бумаге для вырезок от кофе создавал старинные карты, на которых отмечены сокровища на заднем дворе.В настоящее время я обнаружил, что тот же процесс может быть полезен и для фото-проектов. С помощью Photoshop экспериментирование с текстурными слоями — отличный способ придать вашим изображениям состаренный вид. Но иногда бывает сложно найти качественные текстуры в Интернете. Вот тут-то и пригодится немного поделок. Создавая свою собственную текстуру с кофейными пятнами, вы можете создавать, казалось бы, состаренные холсты, которые затем можно применять к вашим изображениям.

Что вам понадобится:

  • 1/4 чашки гранул растворимого кофе
  • 1 чайная ложка
  • влажная ткань, губка или бумажное полотенце
  • несколько листов белой бумаги (я использую простые старые листы копировальной бумаги формата А4.Хотя копировальная бумага морщится при попадании на нее воды, я думаю, что это усиливает общий эффект состаривания. К тому же она дешевле хорошей художественной бумаги!)

Как запачкать бумагу от кофе

  1. Сначала разложите листы бумаги на протираемой поверхности. Я предпочитаю работать на кухонной скамейке.
  2. Посыпьте листы бумаги растворимым кофе — примерно чайная ложка на лист.
  3. С помощью влажной ткани, губки или бумажного полотенца начните вдавливать гранулы растворимого кофе в бумагу.По мере увлажнения кофе вы можете начать распределять гранулы по бумаге более широкими мазками. Чем разнообразнее мазки, тем грубее будет эффект.
  4. При необходимости можно добавить еще кофе и немного воды. Чем больше кофе вы добавите, тем темнее будет бумага с пятнами кофе. Вы даже можете оставить на странице несколько частично растворенных кофейных гранул.
  5. Покрыв бумагу, положите листы в безопасное место и дайте им высохнуть на несколько часов.
  6. Иногда процесс сушки может несколько осветлить эффект пятен.В этом случае добавьте еще кофе и воды, чтобы бумага стала еще темнее.

Вот мой результат:

Как применить текстуры с кофейными пятнами в Photoshop

Когда бумага с пятнами кофе высохнет, отсканируйте или сфотографируйте страницы и сохраните файлы где-нибудь под рукой на компьютере.

Затем откройте изображение в Photoshop. Это будет изображение, к которому мы применим текстуру с пятнами кофе. Я выбрал изображение ниже:

1/100 секунды f / 4.5 ISO 100

Открыв выбранное изображение, добавьте корректирующий слой «Черно-белый», щелкнув значок «Черно-белый» на панели «Коррекция» (названия значков появляются, когда вы наводите на них указатель мыши).

Если вы не видите панель «Коррекция», выберите «Окно» на верхней панели инструментов и нажмите «Коррекция». Корректирующий слой «Черно-белый» преобразует изображение в черно-белое без разрушения.

Переключайте настройки корректирующего слоя «Черно-белый», пока не получите удовлетворительное изображение.

Затем с выбранным корректирующим слоем «Черно-белый» на панели «Слои» нажмите «Файл» на верхней панели инструментов. Затем выберите «Поместить…» и найдите и выберите файл изображения с пятнами кофе.

Текстурный слой с пятнами кофе будет импортирован поверх исходного изображения.

При необходимости отрегулируйте размеры изображения с пятнами кофе, перетащив его углы, чтобы полностью покрыть весь холст.

Выбрав текстуру с пятнами кофе на панели «Слои», щелкните раскрывающееся меню «Режимы наложения», расположенное на панели слоев.Установите режим наложения на Overlay или Soft Light. Overlay немного резче по контрасту, чем Soft Light, поэтому проверьте оба варианта, прежде чем выбирать один.

Затем выберите слой текстуры с пятнами кофе и щелкните значок «Кривые» на панели «Корректирующие слои». Отрегулируйте настройки Кривых, пока не будете довольны общей контрастностью вашего изображения.

На этом этапе вы можете дополнительно уточнить корректирующий слой «Черно-белый» или даже добавить дополнительные слои с пятнами кофе, чтобы увеличить интенсивность эффекта выдержки.

Это мой готовый результат…

Вот еще два изображения, которые я попытался немного состарить тем же методом…

Как вы думаете? Хотите чашку чая? Если вы попробовали метод текстуры с кофейными пятнами, обязательно поделитесь своими результатами в комментариях!

отпечатков — Как удалить водяное пятно с отпечатанной фотографии?

Я бы посоветовал вам сделать еще несколько фотографий, напечатанных на аналогичной бумаге, и поэкспериментировать.Нанесите на них пот, дайте высохнуть, а затем попробуйте разные техники.

A: Нанесите лужу дистиллированной воды на пятно, перемешайте Qtip в течение N минут, затем сначала удалите воду бумажным полотенцем и закончите с куском салфетки для линз. (Вода, попадающая в бумажное полотенце, не попадет на отпечаток.

B: Та же идея, используйте дистиллированную воду, смешанную в соотношении 200: 1 с фотофло.

C: Начните с 1 литра теплой воды и 2 капель неокрашенного средства для мытья посуды. Перемешайте, промокните и сразу же промойте раствором B, указанным выше.Идея в том, что моющее средство удалит остатки кожного жира.

D: Если что-то из вышеперечисленного сработало, попробуйте повторить. Если он работал медленно, смочите его несколько раз, а затем высушите, положив кусок ткани для линз, подложенный бумажным полотенцем. (Полотенце само по себе оставляет ворсинки в желатине.)

E: пятно светлее отпечатка? Если это так, вы можете использовать цвета ретуши, чтобы исправить это. Прежде всего, потренируйтесь. Это приобретенное искусство.

Осмотрите с помощью 10 мощных ювелирных луп.Вы ищите:

  • Есть ли фактическое изменение цвета между внутренней и внешней частью кольца?

  • это все обесцвечивание только в самом кольце? (Поверхностное натяжение способствует скапливанию мусора в том месте, где жидкость встречается с твердой поверхностью. Пятна от кофе — это кольца, а не пятна.

  • есть разница в высоте между внутренней и внешней? (Желатин набух и не сжался. Чтобы проверить это, вы можете использовать освещение под очень низким углом.Хорошо подойдет светодиодный фонарик, лежащий на столе.

  • Есть ли что-то прилипшее к отпечатку?

Осталось ли пятно после обработки? Вы переместили пятно? Если это пятно от кольца, а не пятно, можете ли вы переместить край пятна на незаметное место?

зондов для ядра — Раздел 12.5 | Thermo Fisher Scientific

Часы для этих интерактивных значков
Таблицы —Руководства по выбору и сводная информация для выбранных продуктов.
Технические примечания — Подробный анализ выбранных продуктов и технологий.
Ссылки —Цитаты статей в журнале о наших технологиях маркировки и обнаружения.
Галерея изображений —Продукты Molecular Probes® в действии, вместе с информацией для заказа.

В этом разделе описывается использование красителей нуклеиновых кислот Molecular Probes для визуализации ядер и хромосом, а также для анализа паттернов полос хромосом.Общие химические и спектроскопические свойства этих красителей нуклеиновых кислот описаны в разделе «Пятна нуклеиновых кислот» — Раздел 8.1. Применение красителей нуклеиновых кислот для изучения жизнеспособности клеток, пролиферации и апоптоза обсуждается в разделе «Анализы жизнеспособности, пролиферации и функции клеток» — Глава 15.

Контрастные красители, описанные в этом разделе, совместимы с широким спектром методов цитологического мечения. , включая прямые или непрямые методы обнаружения на основе антител, in situ, гибридизацию и обнаружение специфических субклеточных структур с помощью флуоресцентных зондов, таких как митохондриально-селективные реагенты MitoTracker (Зонды для митохондрий — раздел 12.2), F-актин-селективный фаллоидин (зонды для актина — раздел 11.1) и автофлуоресцентные белки (использование органических флуоресцентных зондов в сочетании с GFP — примечание 12.1).

Флуоресцентные белковые маркеры ядра

CellLight Nucleus-Targeted GFP и реактивы RFP

Реагенты CellLight сочетают полезность и селективность целевых флуоресцентных белков с эффективностью технологии доставки и экспрессии генов BacMam. Эти реагенты включают в себя все обычные преимущества технологии BacMam, включая высокоэффективную трансдукцию клеток млекопитающих и длительную титруемую экспрессию (Технология доставки и экспрессии генов BacMam — Примечание 11.1). Реагенты CellLight поставляются в готовом к использованию формате — просто добавляйте, инкубируйте и изображайте — с высокоэффективной экспрессией в клеточных линиях, первичных клетках, стволовых клетках и нейронах. Полный список реагентов CellLight и их целевых последовательностей можно найти в разделе «Реагенты CellLight и их целевые последовательности» — Таблица 11.1.

CellLight Nucleus-GFP (C10602), CellLight Nucleus-RFP (C10603) и CellLight Nucleus-CFP (C10616) — это векторы экспрессии BacMam, кодирующие слияния зеленого флуоресцентного белка (GFP), красного флуоресцентного белка (RFP) и голубого флуоресцентного белка ( CFP) соответственно с последовательностью ядерной локализации SV40 (NLS).В дополнение к общей идентификации и демаркации ядра в экспериментах по визуализации живых клеток, SV40 NLS-GFP широко используется для анализа ядерно-цитоплазматического транспорта и целостности ядерной оболочки.

CellLight Histone 2B-GFP (C10594) и CellLight Histone 2B-RFP (C10595, , фиг. 12.5.1, ) представляют собой векторы экспрессии BacMam, кодирующие слияния GFP или RFP с гистоном 2B. Мечение гистоном 2B-GFP — это хорошо зарекомендовавший себя и минимально инвазивный подход для визуализации хроматина в живых клетках и особенно полезен для визуализации митотических клеточных делений в реальном времени.

Рисунок 12.5.1 Монтаж изображения, полученный из непрерывного 16-часового промежутка времени, иллюстрирующий динамику цитоскелета и гистонов во время митоза с использованием клеток остеосаркомы U2OS, трансдуцированных реагентами CellLight Histone 2B-RFP (C10595) и CellLight MAP4-GFP (C10598) .

Alexa Fluor 488 Histone h2

Конъюгат Alexa Fluor 488 богатого лизином гистона h2 тимуса теленка (h23188) является полезным зондом для анализа ядерного транспорта белков. Транслокация гистона h2 из ядра в митохондрии указывает на разрывы цепи дцДНК.Флуоресцентные конъюгаты гистона h2 также можно использовать для обнаружения воздействия на поверхность мембраны кислых фосфолипидов, таких как фосфатидилсерин.

(вверху)

Ядерные контрасты для живых клеток и незакрепленных тканей

Окрашивание нуклеиновой кислоты, проницаемой для клеток, позволяет окрашивать живые клетки или ткани, которые были минимально обработаны. Окрашивание ядер может выявить естественное расположение клеток в тканях и может предоставить средства для отслеживания ядерных изменений на протяжении таких процессов, как митоз и апоптоз (Анализы на апоптоз — раздел 15.5). Большинство этих красителей слабо влияют на функцию клеток, позволяя отслеживать движение живых клеток во время развития или заражения других клеток.

Проникающие в клетки голубые флуоресцентные контрастные вещества

Проникающие через мембраны краситель Hoechst 33342 (h2399, h4570, h31492) широко используется для окрашивания ядер живых клеток. Краситель Hoechst 33342 показывает АТ-селективное окрашивание, а окрашенные красителем Hoechst клетки и ткани практически не проявляют цитоплазматического окрашивания. Hoechst 33342 обычно используется для различения компактного хроматина апоптозных ядер в сочетании с маркировкой BrdU для идентификации реплицирующихся клеток и сортировки клеток на основе содержания ДНК (Анализы апоптоза — Раздел 15.5).

В то время как не все синие флуоресцентные проницаемые для клеток красители SYTO в окрашивателях нуклеиновых кислот — Раздел 8.1 демонстрируют избирательное ядерное окрашивание, SYTO 40 (S11351) демонстрирует превосходное окрашивание ядер в эмбрионе пресноводной улитки (). Все синие флуоресцентные красители SYTO, перечисленные в Проникающих в клетки пятен цианиновых нуклеиновых кислот — Таблица 8.3, доступны по отдельности в виде растворов в ДМСО (Окрашивание нуклеиновой кислоты — Раздел 8.1) или в наборе для пробоотборника (S11350), чтобы облегчить поиск лучшего контрастного красителя для конкретный тип клеток или тканей.

Проникающие в клетки зеленые флуоресцентные контрастные вещества

Некоторые из зеленых флуоресцентных проникающих в клетки красителей SYTO (проникающие в клетки цианиновые пятна с нуклеиновой кислотой — таблица 8.3, пятна нуклеиновых кислот — раздел 8.1) являются отличными ядерными красителями для живых клеток в культуры () и для незафиксированных срезов тканей. Зеленый флуоресцентный краситель SYTO 11 (S7573) продемонстрировал избирательное ядерное окрашивание в сердечной ткани, эндотелии сосудов и культивируемых миоцитах, а также в культивируемых клетках гладких мышц сосудов аорты, что указывает на перспективу для широкого использования в исследованиях с помощью неинвазивного конфокального лазерного сканирующего микроскопа.Окрашивание красителями SYTO 11 и SYTO 13 (S7575) облегчало подсчет клеток в срезах мозга без нарушения трехмерной среды. Окрашивание красителем SYTO 11 использовали для отслеживания движения клеток во время развития у целых эмбрионов рыбок данио. Краситель SYTO 11 также использовался для идентификации мейотических клеток в развивающейся мозговой ткани. Trypanosoma cruzi , окрашенный красителем SYTO 11, легко обнаруживается в инфицированных ими клетках. Краситель SYTO 13 использовали в эксперименте с двойной меткой с фаллоидином BODIPY 558/568 (B3475, Зонды для актина — Раздел 11.1) для окрашивания актиновых волокон, позволяя одновременно наблюдать ядерные изменения и изменения цитоскелета в апоптотических клетках. Краситель SYTO 12 (S7574) использовался для отслеживания движения хромосом во время мейоза в живых миоцитах кукурузы, а краситель SYTO 14 (S7576) позволял Исследователи проследили локализацию РНК в живых клетках. Краситель SYTO 16 (S7578) служил эффективным ядерным контрастом в культивируемых клетках и использовался для окрашивания ядер в цельных корнях кукурузы.

Зеленые флуоресцентные красители SYTO, перечисленные в разделе «Окрашивание цианиновых нуклеиновых кислот, проницаемых для клеток» — Таблица 8.3 доступны по отдельности в виде растворов в ДМСО («Пятна нуклеиновых кислот» — раздел 8.1) или как компоненты в наборе для пробоотборника зеленых флуоресцентных пятен нуклеиновых кислот SYTO (S7572). Этот набор для пробоотбора красителей SYTO содержит по 50 мкл каждого из восьми различных зеленых флуоресцентных красителей SYTO для облегчения поиска наилучшего контрастного красителя для определенного типа клеток или тканей.

Проникающие в клетки оранжевые и красные флуоресцентные контрастные вещества

Проникающие в клетки оранжевые и красные флуоресцентные красители нуклеиновых кислот SYTO, перечисленные в разделе «Окрашивание цианиновых нуклеиновых кислот», проникающих в клетки — Таблица 8.3 может также оказаться полезным в качестве ядерного контрастного вещества для живых клеток. Красно-флуоресцентный краситель SYTO 17 (S7579) использовали в качестве ядерного контрастного красителя для зеленого флуоресцентного мембранного окрашивания DiOC 6 (3) (D273, Зонды для эндоплазматической сети и аппарата Гольджи — Раздел 12.4) и с иммуноокрашиванием флуоресцеином. а также с анализом апоптоза TUNEL с использованием ChromaTide fluorescein-12-dUTP (C7604, Анализы для подсчета клеток, пролиферации клеток и клеточного цикла — раздел 15.4) для исследования деградации хроматина и денуклеаризации ткани хрусталика. Клетки Leishmania , окрашенные красителем SYTO 17, позже можно было идентифицировать в клетках, которые они инфицировали. Краситель SYTO 59 (S11341) использовался в качестве красного флуоресцентного ядерного контрастного вещества в сочетании с зеленым флуоресцентным белком (GFP), экспрессируемым в лимфоидных клетках и эмбриональные клетки почек человека (использование органических флуоресцентных зондов в сочетании с GFP — примечание 12.1). Краситель SYTO 59 также оказался очень полезным при исследовании ооцитов Cryptosporidium , поскольку интенсивность окрашивания, по-видимому, связана с инфекционностью ооцитов.

Все эти оранжевые или красные флуоресцентные красители SYTO доступны по отдельности в виде растворов в ДМСО (пятна нуклеиновых кислот — раздел 8.1) или в виде компонентов в наборе для пробоотборника оранжевых флуоресцентных пятен SYTO (S11360) или в наборе для пробоотборников красных флуоресцентных красителей SYTO. (S11340), которые содержат по 50 мкл каждого из шести различных оранжевых флуоресцентных или семи различных красителей SYTO с красной флуоресценцией, чтобы облегчить поиск наилучшего контрастного красителя для определенного типа клетки или ткани.

HCS NuclearMask и HCS CellMask Stains

В анализах высокого содержания (HCS) на основе изображений идентификация клеток или объектов является первым этапом автоматического получения и анализа изображений.Для многих алгоритмов анализа изображений процесс идентификации клеток начинается с обнаружения флуоресцентно окрашенных ядер. Используя положение окрашенного ядра в качестве ориентира, программа затем экстраполирует, чтобы построить маску, которая отмечает вероятное положение цитоплазматической области.

Универсальные красители HCS NuclearMask, которые выдерживают стандартные методы фиксации на основе формальдегида и проницаемости на основе детергентов, можно наносить на живые или фиксированные клетки. Для дополнительной гибкости в мультиплексных экспериментах реагенты HCS NuclearMask доступны в трех флуоресцентных цветах ( Рисунок 12.5.2 ):

Эти три красителя HCS NuclearMask оставляют область длин волн 500–600 нм прозрачной для мультиплексирования с зелеными или оранжевыми флуоресцентными зондами. Предоставляется достаточное количество для окрашивания десяти 96-луночных планшетов с использованием аналитического объема 100 мкл на лунку.

В некоторых приложениях HCS идентификация клеток, основанная только на ядерном окрашивании, неадекватна, потому что цитоплазматическая область, назначенная некоторыми алгоритмами анализа изображений, не точно определяет фактические границы клеток.В дополнение к этим красителям HCS NuclearMask мы предлагаем серию реагентов HCS CellMask, которые маркируют всю клетку (т. Е. Цитоплазму и ядро) и предназначены для обеспечения точного фона для оценки интересующих свойств:

HCS CellMask красители наносятся на клетки сразу после фиксации и пермеабилизации или после мечения антителами. Предоставляется достаточное количество для окрашивания десяти 96-луночных планшетов с использованием аналитических объемов 100 мкл на лунку.

Рисунок 12.5.3 Использование красителя YOYO-1 для отслеживания деления клеток в яйце морского ежа. Краситель YOYO-1 (Y3601) вводили в неоплодотворенное яйцо морского ежа. Яйцо оплодотворяли, а затем наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. В этой последовательности изображения получали каждые 15 секунд. Каждое четвертое изображение отображается в первой части, затем каждое изображение отображается во время разделения хромосом. Изображение предоставлено Марком Терасаки, Центр здоровья Университета Коннектикута.

Ядерные контрасты для фиксированных клеток и тканей

Синие флуоресцентные контрастные пятна

DAPI (D1306, D3571, D21490) — это классический ядерный и хромосомный контрастный краситель для идентификации ядер и наблюдения паттернов распределения хромосом.DAPI избирательно связывается с дцДНК и, таким образом, практически не показывает фоновое окрашивание цитоплазмы. Его относительно низкое флуоресцентное излучение не подавляет сигналы от зеленых или красных флуоресцентных вторичных антител или зондов FISH. DAPI является полупроницаемым для живых клеток и может использоваться на незафиксированных клетках или срезах тканей (,). Мы также предлагаем DAPI, предварительно смешанный с нашими противоуглеродными реагентами SlowFade , SlowFade Gold и ProLong Gold (S36938, S36939, P36931, P36935; аксессуары для флуоресцентной микроскопии и эталоны — раздел 23.1) для одновременного окрашивания ядер и защиты от выцветания.

Краситель Hoechst 33342 (h2399, h4570, h31492) широко используется для окрашивания ядер живых клеток. Красители Hoechst преимущественно связываются с участками AT, что делает их довольно селективными (но не специфичными) для ДНК; Клетки и ткани, окрашенные красителем Hoechst, практически не окрашиваются цитоплазмой (). Краситель Hoechst 33342 обычно используется в сочетании с маркировкой 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU, B23151; маркировка олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот — раздел 8.2) различать компактный хроматин апоптозных ядер, идентифицировать реплицирующиеся клетки и сортировать клетки на основе их содержания ДНК (анализы подсчета клеток, пролиферации клеток и клеточного цикла — раздел 15.4, анализы апоптоза — раздел 15.5).

Синий флуоресцентный краситель нуклеиновой кислоты BOBO-1 (B3582) излучает более яркий флуоресцентный сигнал, чем DAPI. BOBO-1 эффективно использовался в качестве контрастного красителя для хромосом Drosophila в сочетании с антителами, меченными красителем Cy3 или флуоресцеином.Окрашивание нуклеиновой кислоты SYTOX Blue (S11348, S34857) также излучает ярко-синюю флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами и является очень хорошим красителем для ядер. Эмиссия флуоресценции комплекса SYTOX Blue с нуклеиновыми кислотами частично перекрывает эмиссию флуоресцеина, красителей Alexa Fluor 488 и Oregon Green 488, поэтому мы рекомендуем краситель SYTOX Blue только в качестве контрастного красителя для оранжевых или красных флуоресцентных красителей.

Зеленые флуоресцентные контрастные вещества

Некоторые из наших цианиновых красителей (специальные реагенты для нуклеиновых кислот для молекулярной биологии — таблица 8.1, Проникающие через клеточную мембрану окрашивания цианиновой нуклеиновой кислоты — Таблица 8.2, Проникающие в клетку окрашивания цианиновой нуклеиновой кислоты — Таблица 8.3; Окраски нуклеиновой кислоты — раздел 8.1) оказались полезными в качестве флуоресцентных зеленых контрастных красителей для ядер. Краситель YO-PRO-1 (Y3603) и краситель SYTOX Green (S7020) являются отличными ядерными контрастными красителями для клеток в культуре или для целых тканей (,,,), а также являются полезными контрастными красителями для срезов тканей. Краситель SYTOX Green показывает высокоселективное окрашивание ядер; Краситель YO-PRO-1 показывает более интенсивное окрашивание, но также слабо окрашивает цитоплазму и ядрышко.Краситель SYTOX Green использовался для отслеживания изменений ядерной морфологии в апоптозных клетках () и является компонентом некоторых наборов для анализа апоптоза Molecular Probes (Анализы на апоптоз — раздел 15.5). Окрашивание SYTOX Green использовалось в качестве специфического ядерного контрастного красителя для многоцветной маркировки клеток имагинального диска Drosophila . YO-PRO-1, также входящий в состав некоторых наборов для анализа апоптоза Molecular Probes (Анализы апоптоза — Раздел 15.5), избирательно проникает в апоптозные клетки, что позволяет легко идентифицировать эту популяцию клеток с помощью проточной цитометрии ( Рисунок 12.5.4 ). Окрашивание ядер красителем YO-PRO-1 позволило идентифицировать отдельные клетки внутри отдельных живых перфузируемых микрососудов брыжейки.

Окрашивание с помощью красителей нуклеиновых кислот TOTO-1 (T3600) и YOYO-1 (Y3601) обеспечивает чрезвычайно чувствительный проточный цитометрический анализ ядер и изолированных хромосом человека. В этом исследовании окрашивание красителем YOYO-1 давало более чем в 1000 раз сигнал флуоресценции, полученный с митрамицином; кроме того, гистограммы как TOTO-1, так и YOYO-1 на ядрах, обработанных РНКазой, давали коэффициенты вариации, которые были, по крайней мере, такими же низкими, как те, которые были обнаружены для йодида пропидия или митрамицина.Эти исследователи также обнаружили, что при одновременном окрашивании ядер красителями YOYO-1 и Hoechst 33258 (h2398, h4569, h31491) соотношение флуоресценции этих двух красителей варьировалось в зависимости от клеточного цикла. Это наблюдение предполагает, что наши цианиновые красители могут быть полезны для изучения зависимых от клеточного цикла изменений, которые происходят в структуре хроматина. Окрашивание красителем YOYO-1 также позволило обнаружить дискретные рибосомы-содержащие домены в цитоплазме аксонов зрелых клеток, которые, как традиционно считается, не содержат транскрипционной активности.Кроме того, краситель YOYO-1 использовался в качестве контрастного красителя для иммунофлуоресцентного окрашивания хроматина в ядрах развивающихся эмбрионов Drosophila .

Рис. 12.5.4 Проточный цитометрический анализ клеток Jurkat с использованием набора мембранной проницаемости / апоптоза мертвых клеток (V13243), который содержит YO-PRO-1 и йодид пропидия. Клетки Т-клеточного лейкоза человека Jurkat сначала подвергали воздействию 10 мкМ камптотецина в течение 4 часов (левая панель) или оставляли без обработки (в качестве контроля, правая панель).Затем клетки обрабатывали красителями YO-PRO-1 и йодид пропидия (PI), входящими в комплект Membrane Permeability / Dead Cell Apoptosis Kit, и анализировали проточной цитометрией. Обратите внимание, что клетки, обработанные камптотецином (левая панель), имеют значительно более высокий процент апоптотических клеток (обозначен буквой «А»), чем базальный уровень апоптоза, наблюдаемый в контрольных клетках (правая панель). V = жизнеспособные клетки, D = мертвые клетки

Желто-флуоресцентное контрастное окрашивание

Длинноволновый индикатор ядерный желтый (Hoechst S769121, N21485;,) часто сочетается с популярным ретроградным индикатором истинного синего (T1323, полярные индикаторы — раздел 14). .3) для двухцветного нейронального картирования. В нейрональных клетках ядерный желтый цвет в первую очередь окрашивает ядро ​​желтой флуоресценцией, тогда как истинный синий — это возбудимый ультрафиолетовым светом двухвалентный катионный краситель, окрашивающий цитоплазму синей флуоресценцией. И ядерный желтый, и истинный синий стабильны при иммуногистохимической обработке и могут использоваться для фотопреобразования DAB в нерастворимый электронно-плотный продукт реакции (флуоресцентные датчики для фотопреобразования диаминобензидиновых реагентов — примечание 14.2).

Оранжевые флуоресцентные контрастные вещества

Цианиновые красители BOBO-3 (B3586) и SYTOX Orange (S11368) имеют флуоресценцию, аналогичную испусканию PI, но демонстрируют большее усиление флуоресценции при связывании с ДНК и, следовательно, должны обеспечивать более яркое ядерное окрашивание . Краситель BOBO-3 использовался в качестве ядерного красителя в цельных эмбрионах Xenopus laevis . Красители YOYO-3 (Y3606) и YO-PRO-3 (Y3607) демонстрируют сильное и специфическое окрашивание ядра в большинстве культивируемых клеток.

Красные флуоресцентные контрастные окрашивания

Иодид пропидия (PI; P1304MP, P3566, P21493) долгое время был предпочтительным красителем для красного флуоресцентного контрастного окрашивания ядер и хромосом ().При некоторых условиях фиксации PI демонстрирует высокоселективное ядерное окрашивание. Другие препараты клеток и тканей требуют простой обработки рибонуклеазой (РНКазой) для достижения специфического ядерного окрашивания. PI обеспечивает отличное контрастное окрашивание клеток, окрашенных флуоресцентными зондами зеленого цвета или вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488, Oregon Green, BODIPY FL или флуоресцеиновыми красителями.

SYTOX Краситель красных мертвых клеток (максимумы возбуждения / испускания ~ 640/658 нм, S34859) — это высокоаффинный краситель нуклеиновых кислот, который легко проникает в клетки с поврежденными плазматическими мембранами, но не проникает через непроходимые клеточные мембраны.После непродолжительной инкубации с красителем SYTOX Red нуклеиновые кислоты мертвых клеток флуоресцируют ярко-красным цветом при возбуждении на длине волны 633 или 635 нм. Эти свойства в сочетании с более чем 500-кратным усилением флуоресценции при связывании нуклеиновых кислот делают краситель SYTOX Red простым и количественным одноступенчатым индикатором мертвых клеток для использования с проточными цитометрами, оснащенными красным лазером. Используя возбуждение 633 или 635 нм, окраска мертвых клеток SYTOX Red отличается от других зондов мертвых клеток, таких как 7-AAD и PI, которые возбуждаются с использованием 488 нм.Излучение красителя SYTOX Red ограничено одним каналом с минимальным спектральным перекрытием, эффективно освобождая каналы лазерной линии 488 нм.

Длинноволновые красители TOTO-3 (T3604) и TO-PRO-3 (T3605) обеспечивают ядерные контрасты, флуоресценция которых хорошо отделена от флуоресценции широко используемых флуорофоров, таких как наши популярные красители Alexa Fluor, Oregon Green, флуоресцеин ( FITC), родамин (TRITC), красители Texas Red, кумарин (AMCA), красители Marina Blue и Pacific Blue. Их длинноволновые спектры делают эти красители флуоресцентных красителей нуклеиновых кислот особенно полезными для трех- или даже четырехцветной маркировки с использованием конфокального лазерного сканирования или стандартных эпифлуоресцентных микроскопов (,).Пики поглощения красителей TOTO-3 и TO-PRO-3 близко совпадают с лазерными линиями 633 и 635 нм многих конфокальных лазерных сканирующих микроскопов и наборами фильтров соответствия спектров, обычно используемыми для красителей Alexa Fluor 647 и Cy5.

Длинноволновые светопоглощающие красители обладают тем преимуществом, что их флуоресценция обычно не затеняется аутофлуоресценцией тканей. Например, анализ флуоресцентно окрашенных целых эмбрионов Xenopus laevis традиционно был затруднен из-за большого количества автофлуоресценции желтка.Два отчета показали, что краситель TO-PRO-3 может использоваться в качестве флуоресцентного ядерного красителя у этих эмбрионов, что позволяет анализировать их с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Когда спектральные линии 633 нм или 635 нм конфокального лазерного сканирующего микроскопа используются с наборами длинноволновых фильтров, автофлуоресценция желтка почти полностью устраняется.

Красители ТОТО-3 и ТО-ПРО-3 были испытаны в качестве контрастных красителей для фиксированных альдегидом замороженных срезов ткани крыс. Краситель TO-PRO-3 показал меньшее окрашивание цитоплазмы и небольшое перекрытие с сигналами от вторичных антител, меченных флуоресцеином или тетраметилродамином, в том же срезе.Краситель TO-PRO-3 дает сильное и избирательное окрашивание ядра культивируемых клеток. Высокая селективность окрашивания ядер по сравнению с окрашиванием цитоплазмы сделала TO-PRO-3 предпочтительным красителем для обнаружения амплификации гена Her-2 / neu с помощью двухцветного FISH в парафиновых срезах. Хотя его комплекс нуклеиновой кислоты, как сообщается, обесцвечивается относительно быстро, фотообесцвечивание можно замедлить с помощью реагентов против выцветания, таких как наши SlowFade , SlowFade Gold, ProLong и ProLong Gold (аксессуары для флуоресцентной микроскопии и эталонные стандарты — раздел 23.1). Окрашивание ядер красителем TO-PRO-3 было использовано для изучения структуры ядра в интерфазных клетках и для демонстрации сегрегации хромосом во время мейоза в ооцитах мышей. Краситель TO-PRO-3 также использовался для контрастного окрашивания хроматина в ядрах развивающихся эмбрионов Drosophila , иммуноокрашенных красителем Cy3 или антителами, меченными флуоресцеином. Краситель ТОТО-3 использовался в качестве контрастного красителя для тестов TUNEL и для анализов апоптоза на основе аннексина V (Анализы на апоптоз — Раздел 15.5). Краситель TOTO-3 также использовался в сочетании с окрашиванием меченных красителем Cy3 антител против BrdU, чтобы показать, что репликоны, меченные BrdU, образуют кластеры в ядре, которые являются стабильными в течение нескольких клеточных циклов.

SYTOX AADvanced Dead Cell Stain

Специально разработанный для проточной цитометрии краситель SYTOX AADvanced мертвых клеток (максимумы возбуждения / эмиссии ~ 546/647 нм; S10274, S10349) маркирует нуклеиновые кислоты мертвых клеток яркой красной флуоресценцией, когда возбуждается спектральной линией 488 нм аргон-ионного лазера с минимальной компенсацией в зеленом, оранжевом и ближнем инфракрасном каналах.Этот высокоаффинный краситель с красной флуоресцентной нуклеиновой кислотой легко проникает в клетки с поврежденными плазматическими мембранами, но не проникает через мембраны здоровых клеток. Эти свойства в сочетании с более чем 500-кратным усилением флуоресценции при связывании нуклеиновых кислот делают краситель мертвых клеток SYTOX AADvanced простым и количественным одностадийным индикатором мертвых клеток (, рис. 12.5.5, ). Маркировка мертвых клеток достигается очень быстро, обычно в течение 5 минут. SYTOX AAD улучшенная окраска мертвых клеток также может быть полезна для анализа клеточного цикла содержания ДНК с добавлением РНКазы А в фиксированные клетки.

Рисунок 12.5.5 Смесь убитых нагреванием и необработанных клеток Jurkat окрашивали 1 мкМ красителем мертвых клеток SYTOX AADvanced (S10274, S10349) в течение 5 минут. Клетки анализировали на проточном цитометре, оборудованном лазером 488 нм и полосовым фильтром 695/40 нм. Живые клетки легко отличить от популяции мертвых клеток

Qnuclear Deep Red Stain

Qnuclear Deep Red Stain (Q10363) — это яркий и фотостабильный ядерный контраст, разработанный для использования с фиксированными и проницаемыми клетками, которые были помечены нанокристаллами Qdot (Qdot Nanocrystals —Раздел 6.6) и установлен в монтажной среде Qmount Qdot (Q10336, Принадлежности для флуоресцентной микроскопии и эталоны — раздел 23.1) (, рис. 12.5.6, ). При максимумах возбуждения и испускания 640 и 663 нм, соответственно, это контрастное пятно можно визуализировать с помощью стандартных наборов фильтров для флуоресцентной микроскопии. Краситель Qnuclear Deep Red совместим с нанокристаллами Qdot 525, 565, 585, 605 и 625; его также можно использовать с нанокристаллами Qdot 655 и его конъюгатами, хотя необходимо соблюдать осторожность, чтобы использовать соответствующие длины волн возбуждения и наборы фильтров с учетом перекрытия флуоресцентного излучения.

Qnuclear Deep Red краситель предоставляется в виде удобного концентрированного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) с протоколом маркировки, оптимизированным для клеток, которые были фиксированы формальдегидом и проницаемы с помощью Triton X-100; другие методы фиксации могут привести к неспецифическому окрашиванию или аномальной клеточной морфологии. Мечение ядер с помощью окрашивания Qnuclear Deep Red должно быть последним этапом протокола окрашивания клеток.

Набор для ядерной маркировки SelectFX

Набор для ядерной маркировки SelectFX (S33025) содержит четыре спектрально различных флуоресцентных красителя: синий флуоресцентный DAPI, зеленый флуоресцентный краситель SYTOX Green, красный флуоресцентный 7-аминоактиномицин D (7-AAD) и дальний -красный флуоресцентный краситель TO-PRO-3 — для окрашивания ядер в фиксированных и проницаемых клетках и тканях практически без фонового окрашивания цитоплазмы.При использовании в соответствии с предоставленным протоколом красители в наборе для ядерной маркировки SelectFX обеспечивают высокоселективное ядерное окрашивание с незначительной цитоплазматической маркировкой или без нее; они идеальны для использования в качестве контрастных красок в многоцветных приложениях. Окрашенные ядра резко выделяются на фоне других флуоресцентно меченых клеточных структур при наблюдении с помощью флуоресцентной микроскопии. Эти красители имеют длины волн возбуждения, которые соответствуют обычным лазерным линиям для конфокальной микроскопии и проточной цитометрии, и могут использоваться со стандартными наборами фильтров на флуоресцентных микроскопах и считывающих устройствах для микропланшетов.Предлагаемый протокол окрашивания совместим с широким спектром методов цитологического мечения, включая прямые или непрямые методы обнаружения на основе антител, гибридизацию мРНК in situ и методы окрашивания, которые включают флуоресцентные зонды, селективные к органеллам и цитоскелету (включая селективные к митохондриям MitoTracker. зонды и фаллоидины, конъюгированные с красителем Alexa Fluor). Красители можно также использовать для флуоресцентного окрашивания клеток для анализа в экспериментах по многоцветной проточной цитометрии.Все красители поставляются в виде исходных растворов, удобных для разбавления и окрашивания, и каждый краситель также доступен по отдельности.

Набор для ядерной маркировки SelectFX содержит:

  • DAPI, синее флуоресцентное контрастное окрашивание (максимумы возбуждения / испускания ~ 358/451 нм)
  • SYTOX Green, зеленое флуоресцентное контрастное вещество (максимумы возбуждения / испускания ~ 504/523 нм). )
  • 7-аминоактиномицин D (7-AAD), красное флуоресцентное контрастное вещество (максимумы возбуждения / испускания ~ 546/647 нм)
  • Иодид TO-PRO-3, флуоресцентный краситель дальнего красного цвета (максимумы возбуждения / испускания ~ 642/661 нм)
  • Подробные протоколы окрашивания (набор для ядерной маркировки SelectFX)

Набор для ядерной маркировки SelectFX содержит достаточно реагентов для подготовки ~ 100 анализов с каждым окрашиванием по 300 мкл на анализ.

Контрастное окрашивание хромосом

Синие флуоресцентные контрастные пятна для хромосом

DAPI (D1306, D3571, D21490) — это классический синий флуоресцентный контраст для ядер и хромосом. DAPI избирательно связывается с дцДНК и, таким образом, практически не проявляет фонового окрашивания цитоплазмы. Относительно низкий уровень флуоресцентного излучения DAPI не подавляет сигналы от вторичных антител с зеленой или красной флуоресценцией или зондов FISH (, рис. 12.5.7, ,). Мы также предлагаем DAPI, предварительно смешанный с нашими антифадными реагентами SlowFade , SlowFade Gold и ProLong Gold (S36938, S36939, P36931, P36935).Краситель Hoechst 33342 (h2399, h4570, h31492) также широко используется для контрастного окрашивания хромосом; Окраска нуклеиновой кислоты SYTOX Blue (S11348, S34857), которая практически не флуоресцирует, за исключением случаев, когда она связана с нуклеиновыми кислотами, может быть аналогичным образом полезна.

Рисунок 12.5.7 Флуоресценция in situ гибридизационное картирование (FISH) клона ВАС на метафазных хромосомах человека. FISH проводили с использованием клона ВАС, меченного с использованием набора для маркировки ДНК ARES Alexa Fluor 488 (A21665). Хромосомы контрастировали с DAPI (D1306, D3571, D21490).Изображение предоставлено Налласивамом Паланисами, Cancer Genetics Inc.

Зеленые флуоресцентные хромосомные контрасты

SYTOX Green (S7020) и YOYO-1 (Y3601), окрашенные нуклеиновой кислотой, являются полезными зеленовато-флуоресцентными ядерными контрастными красителями из-за их яркого ядерного сигнала и низкого окрашивание цитоплазматического фона. Оба красителя демонстрируют интенсивную зеленую флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами, и стадия промывки не требуется, поскольку красители практически не флуоресцируют в водной среде.Мы обнаружили, что красители SYTOX Green и YOYO-1 обеспечивают простые и надежные флуоресцентные флуоресцентные красители для анализа методом FISH, хотя они несколько различаются по своим свойствам и применению. Оптимальное окрашивание красителем YOYO-1 требует обработки РНКазой для уменьшения фона, тогда как окрашивание красителем SYTOX Green этого не делает. Кроме того, контрастное окрашивание красителем SYTOX Green происходит быстрее, чем контрастное окрашивание красителем YOYO-1. Хотя спектральные свойства двух зеленых флуоресцентных красителей незначительно различаются, нуклеиновые кислоты, контрастирующие с любым из этих зеленых флуоресцентных красителей, могут быть эффективно возбуждены с помощью ртутно-дуговой лампы или аргонового ионного лазера и могут быть визуализированы с помощью стандартных наборов флуоресцентных оптических фильтров. .

Красно-флуоресцентные контрастные вещества для хромосом

Йодид пропидия (PI; P1304MP, P3566, P21493) — это традиционный красный флуоресцентный контрастный краситель для хромосом, который можно возбуждать теми же фильтрами возбуждения, что и для зеленых флуоресцентных зондов. Некоторые из наших длинноволновых цианиновых красителей, включая красители YO-PRO-3, TO-PRO-3, YOYO-3 и TOTO-3, дают красное флуоресцентное ядерное окрашивание, которое можно возбуждать без возбуждения флуоресценции зеленых флуоресцентных красители. Красители TO-PRO-3 (T3605) и TOTO-3 (T3604) демонстрируют излучение длинноволновой флуоресценции (максимум при ~ 660 нм), которое хорошо отделено от излучения других широко используемых флуорофоров, таких как краситель Texas Red, флуоресцеин или красители Alexa Fluor, которые поглощают максимум ниже 600 нм (красители Alexa Fluor, охватывающие видимый и инфракрасный спектр — Раздел 1.3), что делает возможной трех- или даже четырехцветную маркировку. Drosophila политенные хромосомы и ядра культивируемых клеток млекопитающих, окрашенные красителем TO-PRO-3, также были обнаружены с помощью двухфотонной сканирующей оптической микроскопии ближнего поля.

SYTOX Green Nucleic Acid Stain

Хромосомы, окрашенные красителем SYTOX Green (S7020) в сочетании с метиловым зеленым — красителем, связывающим большие бороздки, который селективно связывается с последовательностями AT вдоль хромосомы, — демонстрируют полосу, которая указывает на расположение Области, богатые AT (), представляют собой чрезвычайно простой и быстрый метод группирования на основе флуоресценции, который может оказаться полезным для анализа общего кариотипа.Это наблюдение было использовано для изучения структуры метафазного хроматина. Зеленый флуоресцентный краситель SYTOX Green эффективно возбуждается аргон-ионным лазером, что позволяет анализировать структуру хромосом с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Кроме того, использование красителя SYTOX Green устраняет необходимость обработки слайдов РНКазой.

Акридиновый гомодимер

Водорастворимый акридиновый гомодимер (A666) имеет чрезвычайно высокое сродство к AT-богатым участкам нуклеиновых кислот, что делает его особенно полезным для связывания хромосом.Гомодимер акридина излучает сине-зеленую флуоресценцию при связывании с ДНК, давая флуоресценцию, пропорциональную четвертой степени содержания пары оснований AT. Гомодимер акридина был рекомендован в качестве альтернативы хинакрину для определения Q-полос из-за его большей яркости и более высокой фотостабильности.

Другие красители для полос хромосом

Для разбивки хромосом использовались самые разные флуоресцентные окраски нуклеиновых кислот:

  • 7-Аминоактиномицин D (7-AAD, A1310) селективно связывается с GC-областями ДНК, давая отчетливую полосу узор в политенных хромосомах и хроматине.
  • 9-Амино-6-хлор-2-метоксиакридин (ACMA, A1324) флуоресцирует с большей интенсивностью в областях, богатых AT на хромосомах, давая картину окрашивания, аналогичную картине полос Q, полученной с хинакрином.
  • DAPI () или комбинации DAPI или Hoechst 33258 (h2398, h4569, h31491) с нефлуоресцентными ДНК-связывающими препаратами использовались для исследований хромосомного бэндинга.
  • Потоковое кариотипирование с высоким разрешением также было выполнено с помощью DAPI (D1306, D3571, D21490).
  • Краситель Hoechst 33342 (h2399, h4570, h31492) использовался в сортировке хромосом, многомерном анализе и кариотипировании.
  • Красители Hoechst использовались в сочетании с хромомицином и методом двойного лазера с высоким разрешением для сортировки 21 уникального типа хромосомы человека на нитроцеллюлозных фильтрах с последующей гибридизацией с ген-специфическими зондами.

Флуоресцентные красители Ниссля NeuroTrace

Вещество Ниссля, описанное Францем Нисслем более 100 лет назад, уникально для нервных клеток. Вещество Ниссля, состоящее из огромного количества грубого эндоплазматического ретикулума, отражает необычно высокую способность нейронов к синтезу белка.Для этого контрастного окрашивания использовались различные флуоресцентные или хромофорные «красители Ниссля», включая акридиновый оранжевый, бромид этидия, нейтральный красный (N3246, Реагенты для анализа жизнеспособности и цитотоксичности — Раздел 15.2), крезиловый фиолетовый, метиленовый синий, сафранин-O и толуидиновый синий. О. Мы разработали пять флуоресцентных красителей Ниссля (характеристики флуоресценции флуоресцентных красителей Ниссля NeuroTrace — Таблица 14.2), которые не только обеспечивают широкий спектр флуоресцентных красок для окрашивания нейронов, но также являются гораздо более чувствительными, чем обычные красители:

Кроме того, Вещество Ниссля перераспределяется в теле клетки в поврежденных или регенерирующих нейронах.Следовательно, эти красители Ниссля могут также действовать как маркеры физически или химически индуцированных нейроструктурных повреждений. Окрашивание красителями Ниссля полностью устраняется предварительной обработкой образцов ткани РНКазой; однако эти красители не являются специфическими красителями для РНК в растворах. Сильная флуоресценция (максимум излучения ~ 515–520 нм) зеленого флуоресцентного красителя Ниссля NeuroTrace 500/525 (N21480) делает его хорошим выбором для использования в качестве контрастного красителя в сочетании с оранжевыми или красными флуоресцентными нейроанатомическими индикаторами, такими как DiI ( D282, D3911, V22885; индикаторы для мембранной маркировки — раздел 14.4).

Таблица спектральных и химических данных

Подробное объяснение заголовков столбцов см. В разделе «Определения содержимого таблицы данных»

540 Примечания к растворителю

41

114

6

908 L

H 2 O, DMF

, 11

902 .01

D

905 905 905 M 905 M 905 535

905 905 905

D, L, L, L, L, L

9083 7 S34859

13 D, L

D

Кат. № MW Хранение Растворимый Abs EC Em A1310 1270,45 F, L DMF, DMSO 546 25000 647 H 2 O / ДНК 1
A132837 A171 L ДМФ, ДМСО 412 8200 471 МеОН 2
B3582 1202.66 905 MSO 905 905 905 905 905 MSO 905 905 905 905 481 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
B3586 1254,73 F, D, L DMSO 570 148000 604 905 2 О / ДНК 1, 3, 4, 5
D1306 350.25 L H 2 O, DMF 358 24,000 461 H 2 O / DNA 1, 6
D3571 458,4 2 O, MeOH 358 24,000 461 H 2 O / ДНК 1, 6
D21490 350,25 L O 96

H

358 24,000 461 H 2 O / DNA 1, 6, 7
h2398 623.96 L H 2 O, DMF 352 40,000 461 H 2 O / ДНК 1, 8, 9
h2399 H 2 O, DMF 350 45,000 461 H 2 O / ДНК 1, 8, 10
h4569 623.96 RR

LR 2 O 352 40,000 461 H 2 O / ДНК 1, 3, 8, 9
h4570 615.99 RR, L H 2 O 350 45,000 461 H 2 O / DNA 1, 3, 8, 10
h31491 6 H 2 O, DMF 352 40,000 461 H 2 O / DNA 1, 7, 8, 9
h31492 615,99 L 350 45,000 461 H 2 O / DNA 1, 7, 8, 10
N21479 см. Примечания F, D, L DMSO 435 см. Примечания 457 H 2 O / RNA 3, 5, 11
N21480 см. Примечания 96 F, D, L

497 см. Примечания 524 H 2 O / RNA 905 96

3, 5, 11
N21481 см. Примечания F, D, L DMSO 515 см. Примечания 535 H 2 O / RNA
N21482 см. Примечания F, D, L DMSO 530 см. Примечания 619 H 2 O / RNA 4 3, 5, 5, 5, 5, 5

N21483 см. Примечания F, D, L DMSO 644 см. Примечания 663 H 2 O / RNA 3, 5, 11
L ДМСО 355 36,000 495 H 2 O / ДНК 1
P1304MP 668.40 5400 617 H 2 O / DNA 1, 12
P3566 668,40 RR, L H 2 O H 2 О / ДНК 1, 3, 12
P21493 668.40 L H 2 O, ДМСО 535 5400 617 H 2 O / ДНК 1, 7, 12
S7020 ~ , D, L DMSO 504 67,000 523 H 2 O / ДНК 1, 3, 5, 13
S11348 ~ 400 ДМСО 445 38,000 470 H 2 O / ДНК 1, 3, 5, 13
S11368 ~ 500 96 F, D, L

547 79,000 570 H 2 O / ДНК 1, 3, 5, 13
S34857 ~ 400 F, D, L DMSO 445 DMSO 905 905 38,000 470 H 2 O / ДНК 1, 3, 5, 13
~ 450 F, D, L ДМСО 640 92000 658 H 2 O / ДНК 1, 3, 5, 13
T 1302.78 F, D, L ДМСО 514 117000 533 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
T3604 DMSO 642 154,000 660 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
T3605

671.42 905 908 L 908 ДМСО 642 102,000 661 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
Y3601 1270.65 F, D, L ДМСО 491 99,000 509 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
Y3603 62 D, L DMSO 491 52,000 509 H 2 O / DNA 1, 3, 4, 5
Y3606 1322.73 L 908 ДМСО 612 167000 631 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5
Y3607 655.36 F, D, L ДМСО 612 100,000 631 H 2 O / ДНК 1, 3, 4, 5

  1. представляют собой водные растворы Spectra краситель, связанный с нуклеиновой кислотой. Значения ЕС получены путем сравнения оптической плотности связанного с нуклеиновой кислотой красителя с оптической плотностью свободного красителя в стандартном растворителе (H 2 O или MeOH).
  2. Спектры этого соединения даны в метаноле, подкисленном следами HCl.
  3. Этот продукт поставляется в виде готового раствора в растворителе, указанном в разделе «Растворимый».
  4. Хотя это соединение растворимо в воде, приготовление исходных растворов в воде не рекомендуется из-за возможной адсорбции на стекло или пластик.
  5. Этот продукт практически не флуоресцирует, за исключением случаев, когда он связан с ДНК или РНК.
  6. DAPI в H 2 O: Abs = 342 нм (EC = 28000 см -1 M -1 ), Em = 450 нм. Квантовый выход флуоресценции DAPI, связанного с дцДНК, равен 0.34, что составляет ~ 20-кратное увеличение по сравнению с содержанием свободного красителя в H 2 O.
  7. По данным ВЭЖХ аналитическая чистота этого продукта определена как равная или превышающая 98%.
  8. МВт для гидратированной формы этого продукта.
  9. Квантовый выход флуоресценции Hoechst 33258, связанного с дцДНК, составляет 0,42, что составляет ~ 30-кратное увеличение по сравнению со свободным красителем в H 2 О.
  10. Квантовый выход флуоресценции Hoechst 33342, связанного с дцДНК, составляет 0,38, что соответствует ~ 10-кратное увеличение относительно свободного красителя в H 2 O.
  11. Активным ингредиентом этого продукта является органический краситель с молекулярной массой <1000. Точные значения молекулярной массы и коэффициента экстинкции для этого красителя являются собственностью компании.
  12. Иодид пропидия в H 2 O: Abs = 493 нм (EC = 5900 см -1 M -1 ), Em = 636 нм (слабо флуоресцентный).

    Оставьте комментарий