Капус окрашивание: Применение крем-краски «Kapous Professional»

Крем-краска для волос «Kapous Professional» — «»Очень светлый пепельный блонд»? Сомневаюсь. Оттенок 9.1 — блондинки, не берите!»

Добрового времени суток!

Сегодня речь в пойдет о крем-краска для волос «Kapous Professional» в оттенке 9.1 «Очень светлый пепельный блонд».

Сразу оговорюсь, что к самой этой линейке я отношусь нейтрально — одни оттенки безумно нравятся, а другие же вызывают недоумение и нежелание вообще прикасаться ко всей серии. Так и случилось с цветом 9.1.

Небольшая предыстория, которая позволит вам составить представление о состоянии моих волос:

Перед госами мне необходимо было избавиться от розового цвета волос и приобрести более менее натуральный, дабы не привлекать лишнего внимания. Свои волосы я осветляля приблизительно года 2 и меня устраивал мой цвет, который позволял мне иногда баловаться с яркими нестойкими красителями прямого действия (как, например, Ollin Matisse color Professional).

Концы волос были суховаты, но это вполне простительно кудрявым волосам и их поврежденному осветлением состоянию. Чтобы сделать их внешне более живыми на помощь приходили уже различные несмывашки для волос.

Осветлив корни, попросила сестру купить краску, но нужного оттенка не было и, придерживаясь описания цвета и высокого уровня, сестра взяла этот оттенок. Консультант так же заявляла, что это достаточно высокий уровень и всё будет хорошо, но кто же знал…

Окрашивание я проводила вечером перед экзаменом, поэтому к нервозному состоянию и волнению добавилось еще неприятие своего собственного «я» и расстройство по этому поводу.

А теперь перейдем непосредственно к окрашиванию:

Упаковка у краски превосходная — серебрянная коробочка, внутри которой при развороте содержит полную инструкцию по использованию (фото, к сожалению не сохранилось), сам тюбик выполнен в таком же стиле:

тюбик с краской. сбоку есть деления, которые позволяют иметь представление об оставшемся количестве краски

Разводим краску с окислителем, следуя инструкции, для сохранения состояния волос я добавляю ампулу хромоэнергетического комплекса от estel, а так же, тонируя волосы в блонд я всегда добавляю немного фиолетового корректора, чтобы получить прекрасный цвет без желтизны (тоже от estel).

немного корректора + окислитель

+ампула хэк

размешиваем и наносим на волосы

для удобства — разделите волосы на сектора

волосы после осветления корней и «до» окрашивания

Тонирование волос я всегда делаю сама, поэтому когда краска начала приобретать темный цвет — я занервничала.

паниковать я начала спустя минут 15, когда окрашивание подходило к концу

Когда пришло время смывать краску на моей голове красовалось вот такое:

Вот такой кошмар ждал меня после помывки головы:

Назвать этот цвет даже очень светлым сложно :/

Краска взялась неравномерно: у корней — оттенок был насыщенный и темный, при разном освещении уходил от темно-русого к шоколадному, имел больше теплый подтон; по длине взялся цвет пятнами — от русо-серого, до светло-русого.

Концы на ощупь казались сухими, но винить в этом только краску не могу.

Я была в ужасе. Блонда я добивалась очень долго и к русому цвету возвращаться не собиралась.

И что после окрашивания я имела в итоге?

«после» окрашивания

Обратите внимание на корни, как я и говорила, при разном освещении — разный оттенок:

тут виден шоколадный отлив

А теперь картина в общем:

Неприятный «сюрприз» в виде несоответствия цвета очень подорвал доверие к производителю, теперь я с опаской смотрю на стенд с серебристыми тюбиками.

Однозначно, этот оттенок не подойдет для тех, кто собирается поддерживать светлый блонд и я даже сомневаюсь подойдет ли кому-нибудь, потому что пятнистый эффект в итоге не самый лучший результат.

По стойкости — вымывается цвет достаточно быстро, спустя пару помывок волосы стали выглядеть как какая-то несуразица, поэтому быстро всё это дело было удалено с помощью смывки. Фото этого кошмара, увы, не сохранились

Я НЕ рекомендую ДАННЫЙ оттенок. Всё же это полное непопадание в палитру, заявленную производителем.

Kapous окрашивание

Как часто женщины недовольны цветом волос, которым наградила их природа. Светловолосые мечтают стать жгучими брюнетками, а обладательницы темной гривы желают быть блондинками.
Страсть в смене образов у женщин существует сотни тысяч лет.
Даже великая Клеопатра пользовалась краской для волос из доступных в то время средств, для того чтобы быть более эффектной и прекрасной.

Краска для волос Kapous: новые возможности и максимум цвета

В наши дни девушки стали еще более требовательными к своей внешности. Благо на сегодняшний день выбор средств для окрашивания огромен.
Технологии не стоят на месте, и прилавки заполонили всевозможные краски для волос на любой вкус и кошелек.
Теперь у женщин есть выбор: пользоваться бюджетной хной или приобрести дорогостоящую профессиональную краску. В любом случае всегда существует риск приобрести некачественные и небезопасные средства для волос.

Европейский бренд элитной косметики Kapous решил эту проблему! Теперь у модниц есть возможность приобрести качественные профессиональные средства для окрашивания волос по приятным ценам.
Больше не нужно опасаться подделок и подвергать свои волосы риску их испортить.

В серии средств для окрашивания Kapous каждая девушка найдет то, что ей действительно нужно.
Для блондинок известный бренд выпустил новый инновационный осветляющий порошок с охлаждающим эффектом: больше никаких неприятных ощущений и жжения при осветлении волос.
С обесцвечивающим кремом, который осветляет волосы на 7-9 тонов, превратиться из шатенки в яркую блондинку теперь возможно в одно мгновение!

Кроме того, жертвам неудачного окрашивания другими красками компания Kapous предлагает легкие и безопасные способы смывки нежелательного цвета волос и нейтрализации грязно-желтых оттенков после окрашивания.
Даже мужчины не оказались обделены вниманием команды профессионалов Kapous.
Они выпустили закрашивающую седину гель-краску специально для сильного пола.

Не обошли заботой и девушек, имеющих очень нежную и аллергенную кожу головы.
Щадящие средства для окрашивания волос без аммония и фенилдиамина, с низким содержанием аммиака, а также средства без парфюмерных добавок теперь и в сериях профессионального бренда Kapous!
И приятный бонус: краска для бровей и ресниц с мягкой формулой без вредных компонентов.

Элитные средства для волос только для вас!

Желаете приобрести профессиональную косметику для волос Kapous, но не знаете где найти эти средства? Интернет-магазин Бесткосметика к вашим услугам!
Приятные цены, огромный ассортимент продукции и просто кладезь качественных брендовых товаров по ценам, которые приятно вас удивят!
Оформление заказа всего по одному звонку, недолгое приятное ожидание посылки и желаемые женские радости уже у вас! С магазином Бесткосметика ваша личная коллекция средств по уходу за собой по качеству и разнообразию не будет уступать престижным салонам красоты.

Окрашивание волос KAPOUS в салоне красоты «На Дмитровском»

Окрашивание волос KAPOUS в салоне красоты «На Дмитровском»

«

Kapous Cosmetics» — Kapous (Капус) — европейский бренд элитной косметики

который занимается, в том числе, и выпуском средств для волос. У этой марки масса достоинств. Разработанные и протестированные профессионалами средства для волос производятся на европейских фабриках по современным стандартам качества России и Европы. В течение вот уже нескольких лет продукция Kapous не перестает радовать потребителей новейшими открытиями в области индустрии красоты и моды. Соответствие высочайшим стандартам, идеальное соотношение цены и качества — основа привлекательности средств «Kapous Cosmetics» для клиентов. Огромный опыт компании в разработке средств поддержания природной красоты волос позволил компании создать краску для волос «Kapous Professional». Краска пользуется успехом как среди рядовых парикмахеров, так и у стилистов со стажем. Состав и преимущества Продукция Kapous не содержит аммиака. В состав входит гидролизованный шелк, защищающий волосы от УФ- лучей и сохраняющий цвет надолго. Лоск, долговременный эффект, яркость – вот три кита, лежащие в основе произведения «Kapous Professional». Используя средство, вы получите эффект защитной пленки, оберегающей ваши волосы от повреждений. Волосы станут гладкими, послушными и ухоженными. Красящее средство на 100% закрашивает седину, обеспечивая стойкость и результативность покраски. Не повреждая строения волос, краска сохраняет их мягкими и эластичными, придавая естественный цвет и живой вид на длительный срок.

Европейские и российские стилисты, и их клиенты сразу оценили все достоинства красящей продукции итальянского производителя.

Лучшие салоныв том числе салон красоты На Дмитровском и студии красоты Европы и России среди других средств предлагают окрашивание и краской Капус. Крем-краска для волос Капус Бережное отношение и глубокое стойкое окрашивание – основные требования, которые выдвигались при создании косметики для волос Kapous. В разработке принимали участия дерматологи, стилисты-парикмахеры, химики. В основе краски лежат природные ингредиенты, защищающие волосы в процессе окрашивания. Так, масло какао питает кожу головы, кутикулы, формула «трикопротектив» придает сияние и стойкость. Мягкость и необычная шелковистость – это действие гидролизованного шелка, кератина. В состав краски Капус входят ингредиенты, защищающие волосы от УФ лучей, неблагоприятных природных факторов.

Многочисленные отзывы представительниц прекрасного пола в том числе и клиенток салона красоты На Дмитровском , опробовавших продукт, сводятся к следующему: краска «Капус» – достойный конкурент дорогостоящим аналогам. Стойкость, удобство в использовании, яркость и долговечность цвета, разумная цена, большой выбор цветовой палитры делают средство привлекательным для потребителя.

Цена на окрашивание волос KAPOUS в салоне красоты «На Дмитровском»

стоит или нет заниматься самоудовлетворением?

Предрассудки полового воспитания давали свои плоды не один десяток лет. Даже сегодня, в эпоху сексуальной свободы, развитой индустрии секс-игрушек и one-night stand знакомств вопрос женской мастурбации будоражит умы девочек от 12 до 60.

Еще в Древнем Египте женщины вовсю пользовались фаллоимитаторами (пусть и деревянными или каменными), а первой «просветительницей» в этом деле была горячая Клеопатра.

Позднее в Древнем Риме случился некий апгрейт — фаллосы для натуральности начали обтягивать кожей. Тогда же появились первые вагинальные шарики, но потом пришло христианство и обломало весь кайф. Во всех смыслах. Секс для удовольствия, а тем более мастурбация, считались чем-то греховным, проделками сатаны, деяниями темных сил.

Самоудовлетворение — признак раскрепощенности (грех!) и, что ли, ненадежности женщины. Зачатие ребенка — такова единственная цель полового акта. Сегодня никто не будет креститься только от одного слова «мастурбация», но у многих женщин остался какой-то внутренний запрет или стыд. 

Тем не менее, статистика знает правду и раскрывает все карты. А они говорят о том, что около 75% женщин регулярно мастурбируют. Дальше — интереснее: четыре из десяти опрошенных предпочитают самоудовлетворение сексу с партнером. А потом еще оказалось, что с возрастом женщины мастурбируют чаще, а мужчины — реже. Шах и мат, ханжи!

Читать также
Техники орального секса, которые сведут его с ума

Так почему же мастурбация — это хорошо? Для этого есть минимум четыре причины:

• Познание собственного тела

«Добрый день, давайте знакомиться». Конечно, необязательно говорить эту фразу, но познавать ближе собственное тело — обязательно. Мастурбация позволяет лучше понять свои эмоции и предпочтения, а твоему партнеру вскоре поможет найти те самые заветные точки на теле.

• Мастурбация ослабляет боль

Регулярное самоудовлетворение способно снизить боль во время месячных (особенно в пояснице) и наладить цикл (если у тебя нет проблем со здоровьем). Благодаря сильному, резкому притоку крови к органам малого таза расширяются сосуды. А это, в свою очередь, способствует расслаблению матки и уменьшению спазмов. Священный оргазм выпустит на волю окситоцин, который расслабит мышцы. Еще один плюс регулярной мастурбации — мигрени и раздражительность сводятся к нулю. И никакая таблетка не нужна! 

• Поднимает настроение

Самоудовлетворение имеет такую же пользу, как и секс с партнером. Оргазм снимает сексуальное напряжение, стимулирует выброс эндорфинов в кровь и такого важного для женщины эстрогена. Также к этой веселой гормональной компании присоединяются нейромедиаторы — волшебные биологически активные химические вещества, настоящее спасение от стресса и тревожных мыслей.

• Где и когда угодно

«Снять стресс» можно в любое время, в любом месте. И неважно, есть у тебя партнер или нет. Любить себя и свое тело нужно всегда. И огромный плюс — ты сама контролируешь процесс и всегда (или почти всегда) достигаешь оргазма.

Но в этой бочке меда есть две маленькие ложки дегтя. Первая — мастурбация может нанести вред, если не соблюдать элементарные правила личной гигиены. В первую очередь это касается интимных девайсов. Есть целый ряд правил по уходу за игрушками, их лучше придерживаться. Вторая — к самоудовлетворению можно привыкнуть, так как это самый простой путь к достижению оргазма. Врачи утверждают, что если впасть в зависимость, то в дальнейшем секс не будет уже таким ярким. Но если избежать эти два пункта, а сделать это на самом деле просто, то мастурбация станет безопасным, приятным и полезным досугом.

Всем удовольствий!

Также не пропустите: как ухаживать за секс-игрушкой — что, где, куда?

Материалы по теме:

Профиброзный эпителиальный фенотип: центральная роль MRTF и TAZ

Передача сигналов рецептора эпидермального фактора роста способствует дисфункции эпителиального барьера, вызванной клещами домашней пыли

Abstract

Нарушение функции эпителиального барьера дыхательных путей стало ключевым фактором в патогенезе аллергической астмы.Мы стремились выявить участие рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в индуцированном аллергеном нарушении эпителиального барьера, как мы ранее наблюдали, что клещ домашней пыли (HDM) передает сигналы через EGFR.

Мы исследовали целостность соединений эпителиальных клеток бронхов человека, используя определение импеданса электрических клеток и субстратов и иммунофлуоресцентное окрашивание.

HDM вызывал быстрое временное снижение устойчивости эпителия, сопровождающееся делокализацией E-кадгерина и zona occludens (ZO) -1, а также протеолитическим расщеплением последнего.Ингибирование EGFR с помощью AG1478 уменьшало вызванное HDM снижение эпителиальной резистентности и улучшало восстановление эпителиальных соединений. Точно так же AG1478 увеличивал восстановление эпителиального барьера при повреждении, вызванном электропорацией, хотя он задерживал фазу миграции реакции заживления ран. Перераспределение E-кадгерина, стимулированное HDM, опосредовано через EGFR-зависимую активацию рецептора, активируемого протеазой (PAR) -2, в то время как сопутствующая деградация ZO-1 не зависит от PAR-2 ​​/ EGFR.Важно отметить, что фиброгенный цитокин-трансформирующий фактор роста (TGF) -β пролонгировал индуцированное HDM фосфорилирование EGFR и ингибировал индуцированную лигандом интернализацию / деградацию EGFR, что приводило к устойчивому перераспределению E-кадгерина и ZO-1.

Таким образом, индуцированная аллергеном передача сигналов, опосредованная PAR-2 ​​/ EGFR, снижает устойчивость эпителия и способствует разборке соединений. Передача сигналов EGFR, усиленная TGF-β, может вносить важный вклад в дисфункцию барьера и повышенную уязвимость эпителия в ответ на HDM.

Аллергическая астма характеризуется вызванным аллергеном воспалением дыхательных путей, гиперреактивностью (AHR) и ремоделированием. Дыхательный эпителий образует первый барьер против отложений аэроаллергенов и играет центральную роль в инициации аллергических реакций, а также в ремоделировании дыхательных путей. Разрушение межклеточных контактов не только облегчает транспорт аллергенов, но также может способствовать провоспалительным ответам 1 и высвобождению фактора роста 2 эпителием. Следовательно, стратегии, направленные на поддержание и / или восстановление функции эпителиального барьера, могут иметь решающее значение.Межклеточные соединения являются структурной основой функции эпителиального барьера и включают плотные и сращенные соединения. Адгезивные соединения состоят из молекулы адгезии E-кадгерина, которая регулирует архитектуру эпителия посредством гомофильных взаимодействий и связана с цитоскелетом катенинами 3. Более локализованные на апикальном направлении плотные контакты являются основными факторами устойчивости эпителия, которые ограничивают параклеточную проницаемость. взаимодействующих трансмембранных белков, e.грамм. окклюдина и клаудина, и они прикреплены к цитоскелету с помощью zona occludens (ZO) -1 и цингулина.

Целостность эпителия дыхательных путей часто нарушается при астме с отслоением реснитчатых клеток, снижением экспрессии E-кадгерина на этих участках, нарушением плотных контактов и повышенной проницаемостью для аллергенов 4–6. Многие аллергены, в том числе клещ домашней пыли (HDM), обладают протеолитической активностью, вызывая повреждение эпителия 7, 8. Кроме того, протеазы действуют на рецептор, активируемый протеазой (PAR) -2, рецептор, экспрессируемый эпителием дыхательных путей и связанный с внутриклеточным про -воспалительные сигнальные пути 9.Недавно было описано, что активация PAR-2 ​​нарушает опосредованные E-кадгерином контакты 10 и влияет на целостность эпителия, а также на провоспалительную активность 1. Кроме того, подавление E-кадгерина является ключевым компонентом перехода от эпителия к мезенхиме. (EMT), процесс восстановления и ремоделирования тканей. Важно отметить, что недавние исследования показывают, что EMT способствует развитию аномального фенотипа астматического эпителия 11,12.

Тем не менее, механизм, лежащий в основе структурных изменений протеолитически активных, но обычно безвредных аллергенов при астме, все еще не определен.Эпителий астмы может быть более уязвимым 6 и / или неэффективным в регенерации после травмы, что подтверждается повышенными уровнями маркеров репарации, трансформирующих фактор роста (TGF) -β и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) в дыхательных путях астмы 2, 13, 14 Несмотря на доказательства того, что EGFR активируется при астме 15, функциональное значение неясно. Ранее мы наблюдали, что EGFR является решающим в индуцированной HDM передаче сигналов в бронхиальном эпителии 16. Здесь мы стремились определить, участвует ли EGFR также в структурных изменениях при воздействии HDM.Мы наблюдали, что HDM временно разрушает эпителиальные соединения, в которые активация EGFR вносит значительный вклад. Более того, присутствие TGF-β поддерживает EGFR-опосредованное разрушение эпителиальных соединений и, таким образом, может повышать уязвимость к HDM.

МЕТОДЫ

Культивирование клеток и стимуляция

Линия клеток бронхиального эпителия человека 16HBE14o- (16HBE) была любезно предоставлена ​​DC Gruenert (Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Калифорния, США) и культивирована в среде EMEM / 10% фетальной телячьей сыворотке (Biowhittaker, Verviers, Бельгия) с 100 Ед · мл ^-1 пенициллин / 100 мкг · мл ^-1 стрептомицин во флаконах, покрытых коллагеном, как описано ранее 1.Первичные бронхиальные эпителиальные клетки были получены из Lonza (Walkersville, MD, USA) в виде криоконсервированного пассажа 1 нормального бронхиального эпителия человека (NHBE). Клетки культивировали в среде для роста бронхиального эпителия с добавками гормонов (Lonza), в покрытых коллагеном / фибронектином колбах 17 и использовали для экспериментов на пассаже 2. Клетки высевали в количестве 50 × 10 ³ клеток · мл ^-1 в чашках или 75 × 10 ³ клеток · матрица ^-1 для определения импеданса между клетками и субстратом (ECIS) и выращенные до слияния.Ингибитор EGFR AG1478 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), ингибитор ADAM TAPI-2 (Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США) и циклогексимид (CHX; Sigma) добавляли за 60-120 минут до стимуляции HDM (Greer Laboratories, Ленуар, Северная Каролина, США), TGF-β (Sigma), активирующий пептид PAR-2 ​​или эпидермальный фактор роста (EGF; Sigma). Ингибитор сериновой пептидазы AEBSF добавляли к экстракту клеща на 60 мин при 37 ° C. Кроме того, первичные эпителиальные клетки, полученные из чистки бронхов у пациентов с астмой, культивировали и использовали для экспериментов, как описано ранее 16.

ECIS

Электрические свойства сливающегося или раненого эпителия измеряли с помощью электрического ECIS, как описано ранее 18. Измерения клеточной адгезии основывались на изменениях сопротивления / емкости току, приложенному с разными частотами (Applied Biophysics, Troy, NY, USA). Клетки инокулировали в количестве 75 × 10 ³ клеток · лунка ^-1 в 400 мкл в дубликатах, и сопротивление / емкость измеряли при 400 и 40 000 Гц. Ранение выполняли электропорацией с использованием импульсов напряжения 5 В и 40 кГц в течение 30 с.

Иммунодетекция вестерн-блоттингом

Общие клеточные лизаты получали ресуспендированием клеток в буфере Лэммли. Иммунодетекцию проводили, как описано ранее 1, с использованием анти-EGFR, анти-фосфо-EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния), антифосфо-внеклеточной регулируемой киназы (ERK; Cell Signaling Technology, Hitchin, UK), анти- окклюдин и анти-ZO-1 (Zymed Laboratories, Сан-Франциско, Калифорния, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки, выращенные на LabTeks, промывали PBS / CaCl ₂ , фиксировали ледяной ацетон (90%) в течение 30 минут, блокировали PBS / 5% бычий сывороточный альбумин в течение 60 минут, инкубировали в течение 60 минут с первичными антителами ( 1: 200) против EGFR, E-кадгерина (Santa Cruz) и ZO-1 (Zymed), а затем инкубировали в течение 60 минут с меченными FITC антикроличьими антителами (1: 200; DAKO Diagnostics, Mississauga, ON, Canada) или родамином. меченые конъюгаты антимышиного иммуноглобулина G (1: 400; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA) и анализировали, как описано ранее 19.

Просвечивающая электронная микроскопия

Клетки фиксировали в течение 1 ч при комнатной температуре и в течение ночи при 4 ° C в 2% PFA, 2,5% глутаровом альдегиде и 0,1 моль · л ^-1 какодилата натрия, pH 7,4 и готовили для ТЕА, как описано ранее. ПЭМ проводилась в основном центре больницы Mount Sinai Hospital (Торонто, Онтарио, Канада).

Биотинилирование клеточной поверхности

Клетки промывали четыре раза PBS, содержащим 1 мМ MgCl ₂ и 0,1 мМ CaCl ₂ , и инкубировали с 1.5 мг · мл ^-1 сульфосукцинимидил 2- (биотинамидо) этилдитиопропионат (сульфо-NHS-SS-биотин) дважды в течение 20 минут с последующей промывкой 50 мМ NH ₄ Cl в PBS / MgCl ₂ / CaCl ₂ для гашения свободного сульфо-NHS-SS-биотина с последующими четырьмя дополнительными промывками в PBS / MgCl ₂ / CaCl ₂ . Затем клетки промывали ледяным PBS, содержащим 1 мМ ортованадата натрия (Na ₃ VO ₄ ) и 1 мМ PMSF, а затем лизировали в 200 мкл буфера для лизиса тритона (30 ммоль · л ^-1 HEPES (pH 7). .4), 100 ммоль · л ⁻¹ NaCl, 1 ммоль · л ⁻¹ ЭГТА, 20 ммоль · л ⁻¹ NaF, 1% Triton X-100, 1 ммоль · л ⁻¹ PMSF, 20 мкл · мл ^-1 коктейль ингибиторов протеазы (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США) и 1 ммоль · л ^-1 Na ₃ VO ₄ ) в течение 20 мин на льду. Лизаты клеток центрифугировали при 10000 × g в течение 15 мин и инкубировали со стрептавидиновыми гранулами для сбора связанных биотинилированных белков. После этого иммунные комплексы трижды промывали буфером для лизиса.Осадки подвергали SDS 10% PAGE, иммуноблотировали на нитроцеллюлозной мембране, и E-кадгерин и EGFR детектировали с использованием усиленной хемолюминесценции, которая выполнялась в соответствии с инструкциями производителя. Во всех случаях мембраны окрашивали Ponceau S (Sigma), чтобы гарантировать равную загрузку и перенос белков.

Статистический анализ

Мы использовали ранговый критерий Стьюдента Вилкоксона для парных наблюдений для анализа до и после или U-критерий Манна-Уитни для анализа значимости между различными состояниями при измерениях сопротивления эпителия.

РЕЗУЛЬТАТЫ

HDM вызывает кратковременные изменения в формировании эпителиального барьера

Потеря соединения E-кадгерина с нарушением межклеточных контактов, как это наблюдается при астме, может иметь важные последствия для функции эпителия дыхательных путей. Соответственно, контактное повреждение является ключевым компонентом EMT 20, процесса, который может способствовать ремоделированию эпителия дыхательных путей при аллергической астме 11, 12. Поэтому мы стремились изучить влияние HDM на межклеточные соединения.Мы наблюдали, что и ZO-1, и E-кадгерин, маркеры плотных и адгезионных контактов, соответственно, были локализованы в межклеточных соединениях в условиях покоя, образуя непрерывное кольцо. После воздействия HDM, E-кадгерин принял неровную структуру, и окрашивание ZO-1 стало прерывистым, иногда с полной потерей соседних границ клеток в течение 15 минут (рис. 1a-f). Через 60 минут эпителиальный барьер был восстановлен, о чем свидетельствует изменение локализации ZO-1 и E-кадгерина на мембране (рис.1а – е).

Рисунок 1-

Клещ домашней пыли (HDM) вызывает кратковременные изменения эпителиальных межклеточных контактов. Клетки 16HBE были засеяны в LabTeks или наборах Electric Cell-Substrate Impedence Sensing (ECIS) в дубликатах, выращены в течение 3-5 дней, лишены сыворотки в течение ночи и подвергнуты воздействию HDM (50 мкг · мл ^-1 ) или носителя (среда) . а, б) Контроль, в – е) клетки подвергали действию HDM в течение в, г) 15 мин и д, е) 60 мин. a, c, e) E-кадгерин и b, d, f) zona occludens-1 были обнаружены иммунофлуоресцентным окрашиванием.Показаны представители трех независимых экспериментов. ж) Сопротивление измеряли при 400 Гц. Чтобы скорректировать межскважинную дисперсию, значения сопротивления были нормализованы к начальной точке на непокрытом электроде. Показано нормированное сопротивление репрезентативного эксперимента от 60 до 85 часов. HDM (#) добавляли примерно через 70 ч после инокуляции. Транспортное средство: —-; HDM: ––––. h) Показаны абсолютные значения сопротивления до (t = 0), а также через 15 и 60 минут после воздействия HDM. n = 14. **: p <0,01. i) Емкость была измерена на частоте 40 кГц с использованием ECIS, и показана нормализованная емкость типичного эксперимента от 60 до 85 часов.HDM (#) добавляли примерно через 70 ч после инокуляции. ----: транспортное средство; ––––: HDM.

После этого мы проверили, были ли эти изменения в барьерной структуре параллельны изменениям в барьерной функции. Мы измерили сопротивление эпителия при 400 Гц (с помощью ECIS), поскольку было продемонстрировано, что низкочастотное сопротивление наиболее чувствительно к изменениям плотности барьера 18. Напротив, измерение емкости при 40 кГц является наиболее чувствительным параметром для отслеживания изменений в клетке. прикрепление к матрице, будучи относительно нечувствительным к образованию межклеточного контакта 18.Мы наблюдали, что добавление HDM вызывало быстрое и существенное (~ 20%) падение низкочастотного сопротивления (рис. 1g, h), но не высокочастотной емкости (рис. 1i), что указывает на избирательное разрушение межклеточного сопротивления. -клеточная адгезия 18. Этот эффект был временным: сопротивление вернулось к своим исходным значениям в течение ~ 1 часа, что сопровождалось изменением локализации ZO-1 и E-кадгерина на мембране. Примечательно, что в течение нескольких часов можно было наблюдать тенденцию ко второму, менее крутому и более продолжительному снижению сопротивления (p = 0.07 для , обработанного HDM, по сравнению с контрольными значениями ).

HDM активирует EGFR протеазозависимым образом, что приводит к перераспределению E-кадгерина и делокализации ZO-1

Чтобы раскрыть механизмы, лежащие в основе индуцированного HDM контактного повреждения, мы сочли, что передача сигналов EGFR может вносить вклад в этот тип повреждения, основываясь на наших предыдущих открытиях, показывающих, что активность EGFR играет решающую роль в индуцированной HDM передаче сигналов в эпителии бронхиальной астмы 16. Действительно. , мы наблюдали, что HDM активировал EGFR, а также нижестоящую передачу сигналов, что было обнаружено по повышенным уровням фосфо-EGFR (Tyr 1173) и фосфо-ERK, с максимальным эффектом 5–20 минут после воздействия HDM (рис.2а). Этот временной ход соответствует временному уменьшению барьерной функции. Это может включать активацию PAR-2, что приводит к ADAM17-зависимому отщеплению связанного с гепарином-EGF 16, 21–23 или TGF-α 24. Аллерген Der p 1, как известно, действует как цистеинпептидаза, тогда как Der p 3, Der p 6 и Der p 9 содержат активность сериновой протеазы. Примечательно, что сериновые протеазы, присутствующие в экстракте HDM, как было показано, активируют PAR-2 ​​22. Используемый нами экстракт был протеолитически активен с детектируемой сериновой, но не цистеиновой пептидазной активностью (данные не показаны).Интересно отметить, что после тепловой инактивации, а также обработки ингибиторами сериновых и цистеиновых протеаз мы все же обнаружили значительные уровни протеолитической активности (данные не показаны). Это указывает на то, что дополнительные, нечувствительные к нагреванию, но еще предстоит определить протеазы, также могут способствовать эффекту HDM. Соответственно, индуцированное HDM фосфорилирование EGFR снижалось после предварительной обработки ингибитором сериновой протеазы AEBSF, что указывает на то, что это, по крайней мере, частично зависит от активности сериновой протеазы (рис.2а). Чтобы оценить, может ли быть задействован механизм, зависимый от сериновой протеазы / PAR2, мы использовали PAR2-активирующий пептид (PAR2-ap) и наблюдали аналогичное увеличение фосфо-EGFR. Это зависело от активности ADAM, поскольку она блокировалась ингибитором ADAM TAPI-2 (рис. 2b). Более того, нижестоящая передача сигнала PAR-2 ​​зависела от EGFR, поскольку индуцированный PAR2-ap ответ фосфо-ERK-1/2 подавлялся ингибитором EGFR AG1478 (фиг. 2b). Кроме того, как PAR2-ap, так и EGF были способны имитировать индуцированное HDM перераспределение E-кадгерина.В соответствии с этим и AEBSF, и AG1478 блокировали индуцированное HDM перераспределение E-кадгерина (рис. 2c). Аналогичный эффект оказал ТАПИ-2 (данные не показаны). Эти результаты предполагают участие протеазного / PAR-2 ​​/ ADAM / EGFR-зависимого пути в индуцированной HDM дестабилизации E-кадгерина. Чтобы найти дополнительную поддержку ADAM-зависимого отщепления лигандов EGFR с помощью HDM, мы использовали нейтрализацию α-EGFR для блокирования лиганд-зависимой активации рецептора. Мы заметили, что HDM больше не может увеличивать фосфорилирование EGFR в присутствии α-EGFR (рис.2в). Кроме того, AG1478 увеличивал мембранную локализацию ZO-1 после воздействия HDM (рис. 2d). Это отражалось в изменении функции эпителиального барьера; AG1478 значительно снижал (хотя и не мог полностью блокировать) вызванное HDM падение эпителиальной резистентности (рис. 2e, f).

Фигура 2-

Зависимая от протеазы активация рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) клещом домашней пыли (HDM) участвует в нарушении межклеточных контактов. Клетки 16HBE выращивали в течение 3-5 дней в 24-луночных планшетах, LabTeks или наборах Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, лишали сыворотки в течение ночи, инкубировали с или без ингибитора EGFR AG1478 (1 мкМ), TAPI-2 (22.5 мкМ), AEBSF (1 нМ) или α-EGFR (1 мкг · мл ⁻¹ ) в течение 60–120 мин и подвергнутым воздействию HDM (50 мкг · мл ⁻¹ ), активируя рецептор-2, активируемый протеазой. пептид (PAR2-ap; 50 мкМ) или эпидермальный фактор роста (EGF; 10 нг · мл ^-1 ), как указано. a – c) Были приготовлены полные клеточные лизаты, и фосфо-внеклеточно-регулируемая киназа (ERK) или фосфо-EGFR была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга (стрелка). β-актин использовали в качестве контроля для равной нагрузки. Показаны представители трех независимых экспериментов.d) E-кадгерин и e) zona occludens-1 обнаруживали иммунофлуоресцентным окрашиванием. Показаны представители трех независимых экспериментов. е) Нормированное сопротивление репрезентативного эксперимента от 60 до 70 часов. HDM (#) добавляли примерно через 75 ч после инокуляции. AG1478: ––––; контроль: —. g) Показаны абсолютные значения сопротивления до (t = 0) и 15 мин, 1 час и 3 часа после воздействия HDM. n = 9. *: p <0,05; **: p <0,01; ***: p <0,001. Сопротивление измеряли при 400 Гц. AG1478 (1 мкМ) добавляли за 2 часа до добавления HDM / наполнитель.

EGFR участвует в реорганизации эпителия при ранении электропорацией

Подобно HDM-индуцированному повреждению, мы наблюдали, что ингибирование EGFR улучшает восстановление эпителия при повреждении электропорацией. В этих обстоятельствах при относительно небольшой площади раны ожидается, что целостность эпителия восстановится в течение нескольких часов, , то есть , за счет миграции / распространения клеток, а не пролиферации. После восстановления монослоя сопротивление может еще больше увеличиваться из-за восстановления межклеточных контактов.Действительно, клетки повторно заселили электрод в течение 2 часов, что наблюдалось по стабилизации высокочастотной емкости (рис. 3b). Впоследствии уровни сопротивления медленно продолжали расти, указывая на формирование межклеточного контакта (рис. 3а). AG1478 заметно задержал повторное заселение электрода в течение 2 часов после ранения, с увеличением на 19 ± 7% по сравнению с на 51 ± 10%. Эта задержка также наблюдалась для высокочастотной емкости (рис. 3b) и, вероятно, связана с ингибированием распространения / миграции клеток.Напротив, AG1478 увеличивал восстановление эпителиального барьера через 2 часа, что отражалось в дополнительном 42,2 ± 9% повышении устойчивости по сравнению с , т.е. на 10 ± 12% при его отсутствии (n = 4). Добавление EGF перед ранением имело противоположный эффект; он способствует фазе миграции (рис. 3c, d), но нарушает восстановление эпителиального барьера (рис. 3c), указывая на то, что активность EGFR облегчает фазу миграции и ингибирует реорганизацию контактов во время регенерации эпителия.

Рисунок 3–

Ингибирование активности рецептора эпидермального фактора роста (EGF) увеличивает распространение / прикрепление и снижает образование межклеточных контактов при ранении электропорацией. Клетки 16HBE были засеяны в двух экземплярах в матрицу Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS), выращены в течение 3 дней, лишены сыворотки в течение ночи, предварительно обработаны (–––) или без (·······) a, б) AG1478 (1 мкМ) или в, г) EGF (10 нг · мл ^-1 ) в течение 6–8 ч и ранен электропорацией. a, c) сопротивление измеряли при 400 Гц и b, d) емкость измеряли при 40 кГц с помощью ECIS.Нормированные сопротивление и емкость типичных экспериментов показаны за 4 часа до ранения и через 4 часа после ранения.

HDM индуцирует EGFR-независимое расщепление соединительных белков

Первоначальное падение сопротивления, вызванное HDM, которое, по-видимому, частично не зависело от EGFR, могло быть вызвано кратковременными изменениями герметичности соединения. Помимо перераспределения ZO-1, может быть вовлечена деградация белков плотных контактов 25, 26. Мы исследовали, влияет ли HDM на компоненты внеклеточных и / или внутриклеточных плотных контактов, e.грамм. окклюдин и ZO-1 через такие механизмы. Действительно, HDM индуцировал частичное расщепление окклюдина, о чем свидетельствует уменьшение его гиперфосфорилированной формы 80 кДа 27 и появление более мелких фрагментов расщепления (~ 45 и ~ 30 кД). Мы также наблюдали частичное расщепление ZO-1 при воздействии HDM на более мелкие продукты (∼192 и ∼165 кДа). Как и ожидалось, присутствие AG1478 не могло предотвратить деградацию ZO-1 или окклюдина (рис. 4a). Кроме того, расщеплению ни одного белка не препятствовал AEBSF (данные не показаны), что предполагает участие других протеолитических / ферментативных активностей или протеаз, активируемых HDM.В дополнение к активности серинпептидазы экстракт содержал хитиназную активность (~ 20 ед. · Мкл ^-1 β-N-ацетилглюкозаминидазы), но в настоящее время неизвестно, может ли окклюдин служить субстратом для хитиназ. Экстракты HDM часто загрязнены эндотоксином. Однако уровни эндотоксина в нашем экстракте были относительно низкими (, т.е. 0,5 ЕС · мкл ^-1 , как определено тестом на эндотоксин с лизатом амебоцитов Limulus, что дает конечную концентрацию 2,5 ЕС · мл ^-1 в наших клетках). .Уровни липополисахаридов до 50 000 EU · мл ^-1 не влияли на целостность эпителия (рис. 4b). Таким образом, участие эндотоксинов представляется маловероятным.

Рисунок 4–

a) Клещ домашней пыли (HDM) индуцирует кратковременное расщепление белков TJ независимо от рецепторов эпидермального фактора роста. Клетки 16HBE находились в течение 3-5 дней в 24-луночных планшетах, лишались сыворотки в течение ночи и подвергались воздействию HDM (50 мкг · мл ^-1 ) в течение 60 минут. AG1478 (1 мкМ) добавляли за 2 ч до стимуляции HDM.Полноразмерный окклюдин (60–80 кДа), zona occludens-1 (ZO-1; 220 кДа) и продукты их расщепления были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга и обозначены стрелками. б) Воздействие липополисахарида (LPS; 500 EU · 10 ^-1 мкл) не снижает барьерную функцию эпителия. Клетки 16HBE выращивали в течение 3-5 дней в наборах импеданса электрических клеток и субстратов, лишали сыворотки в течение ночи и подвергали воздействию HDM (50 мкг · мл ^-1 ; ·····) или LPS (––––). Сопротивление измеряли при 400 Гц. Показана стойкость репрезентативного эксперимента от 85 до 100 ч.HDM и LPS добавляли примерно через 90 ч после инокуляции.

Передача сигналов через EGFR и последующие изменения в формировании межклеточных контактов стимулируются в эпителии, примированном TGF-β.

Вместе вышеперечисленные данные предполагают, что сигналы, которые ограничивают передачу сигналов EGFR, , например, лиганд-индуцированная интернализация EGFR / лизосомная деградация 28 может улучшить восстановление эпителия после повреждения. Напротив, устойчивая передача сигналов EGFR может ослаблять восстановление эпителиального барьера. Поскольку наши предыдущие результаты показали, что TGF-β продлевает индуцированную лигандом активацию EGFR 11, мы исследовали, способен ли TGF-β откладывать прекращение передачи сигналов EGFR и тем самым влиять на функцию эпителиального барьера.Сначала мы изучили, изменяет ли TGF-β клеточную судьбу EGFR посредством воздействия на эндоцитоз и деградацию. Длительная обработка EGF (6 ч) приводила к подавлению экспрессии EGFR (рис. 5a). Важно отметить, что предварительная обработка TGF-β существенно смягчала это (фиг. 5a), в то время как TGF-β сам по себе не имел такого эффекта и даже увеличивал экспрессию белка EGFR (фиг. 5b). Когда синтез нового белка ингибировался с помощью CHX, воздействие на клетки EGF вызывало резкое снижение экспрессии EGFR, демаскируя устойчивую деградацию рецептора, стимулированную EGF.Опять же, предварительная обработка TGF-β почти полностью устраняла EGF-индуцированную деградацию EGFR (фиг. 5c). Кроме того, EGF вызывает полную интернализацию EGFR в эндосомный везикулярный компартмент. В клетках, обработанных TGF-β, помимо везикулярного накопления, все еще наблюдалась четкая цитоплазматическая и периферическая маркировка EGFR. Это также было продемонстрировано более высокими уровнями биотинилированного EGFR на клеточной поверхности по сравнению с обработкой только EGF (фиг. 5d, e). В совокупности эти данные предполагают, что TGF-β может вносить вклад в поддержание EGFR за счет усиления экспрессии EGFR, снижения интернализации EGFR и предотвращения деградации интернализованного EGFR.

Рисунок 5–

Трансформирующий фактор роста (TGF) -β предотвращает деградацию рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), снижает эндоцитоз EGFR и продлевает индуцированную клещами домашней пыли (HDM) передачу сигналов EGFR. Клетки 16HBE выращивали в течение 3 дней в 24-луночных планшетах или LabTeks, лишали сыворотки на 4 часа, предварительно обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали TGF-β (2 нг · мл ^-1 ), эпидермальный фактор роста (EGF; 10 нг · мл ^-1 ) или HDM (50 мкг · мл ^-1 ), как указано, в присутствии и в отсутствие циклогексимида (CHX; 10) мкг · мл ^-1 ).a – c) Были приготовлены общие клеточные лизаты, и EGFR был определен с помощью вестерн-блоттинга (стрелка). β-актин использовали в качестве контроля для равной нагрузки. Показаны представители трех независимых экспериментов. г) Клетки выращивали на LabTeks, и EGFR определяли иммунофлуоресцентным окрашиванием. EGFR, локализованный на клеточной мембране, показан стрелками. д) Поверхность клеток подвергали биотинилированию и лизированию. Биотинилированные белки выделяли с использованием гранул стрептавидина и анализировали с помощью SDS-PAGE. EGFR определяли вестерн-блоттингом (стрелка).е, ж) Готовили полные клеточные лизаты и определяли EGFR и фосфо-EGFR с помощью вестерн-блоттинга (стрелка). β-актин использовали в качестве контроля для равной нагрузки. Показаны представители трех независимых экспериментов.

В соответствии со сниженным фосфорилированием при длительном воздействии HDM, HDM также индуцировал подавление экспрессии EGFR (фиг. 5f) и вызывал интернализацию EGFR, что предотвращалось предварительной обработкой TGF-β (фиг. 5d, e). TGF-β увеличивал фосфорилирование EGFR (рис. 5g), и как базальное, так и индуцированное TGF-β фосфорилирование EGFR было дополнительно усилено HDM, эффект, который сохранялся в течение длительных периодов в обработанных TGF-β клетках (рис.5г).

После этого мы проверили последствия устойчивой передачи сигналов EGFR при лечении TGF-β. Сам по себе TGF-β не оказал большого влияния на локализацию E-кадгерина (рис. 6a, b), однако он продлил HDM-индуцированную делокализацию E-кадгерина, а также ZO-1, которая все еще наблюдалась через 60 минут ( рис.6а, б). AG1478 заблокировал перераспределение ZO-1 (рис. 6а). Кроме того, электронно-микроскопический анализ выявил значительное уменьшение межклеточных плотных контактов в клетках, подвергшихся воздействию комбинации TGF-β и HDM по сравнению с контрольными клетками (рис.6в). Соответственно, хотя TGF-β сам по себе не оказывал значительного влияния на резистентность эпителия, индуцированное HDM снижение эпителиальной резистентности усиливалось TGF-β, которое становилось значительным после длительного воздействия (как показано для 8-часовой временной точки) ( рис. 6d).

Рисунок 6–

Предварительная обработка трансформирующим фактором роста (TGF) -β продлевает вызванное домашним пылевым клещом (HDM) разрушение эпителиальных контактов. a, b) клетки 16HBE культивировали в LabTeks в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ), как указано, в присутствии и в отсутствие AG1478 (1 мкМ).a) E-кадгерин и b) zona occludens (ZO) -1 были обнаружены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Показаны представители трех независимых экспериментов. c) клетки 16HBE выращивали на покровных стеклах в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ⁻¹ ) в течение 6 ч. Электронно-микроскопический анализ плотных контактов проводился, как указано (белые стрелки). Показаны репрезентативные изображения, полученные с помощью электронной микроскопии.г) Клетки выращивали на массивах измерения импеданса электрических клеток и субстратов (ECIS) в дубликатах в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи с TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ), а затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ) / носитель. Сопротивление измеряли через 0 и 8 часов после обработки HDM при 400 Гц с использованием ECIS. n = 6. *: p <0,05. Указаны средние значения. Нормальные первичные эпителиальные клетки бронхов, полученные из Lonza (Walkersville, MD, USA) e), и эпителиальные клетки, полученные из чистки бронхов при астме 16, выращивали до слияния в LabTeks в течение 3-5 дней, лишенные фактора роста / гормона в течение 4 часов до - обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ) или эпидермальным фактором роста, как указано.E-кадгерин и ZO-1 были обнаружены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Показаны представители трех независимых экспериментов. f) Полные клеточные лизаты получали из эпителиальных клеток бронхиальной астмы 16, и ZO-1 определяли вестерн-блоттингом (стрелка). Показаны представители трех независимых экспериментов.

Наконец, чтобы проверить актуальность наших выводов, мы изучили NHBE. EGF также индуцировал делокализацию E-кадгерина и ZO-1 в клетках NHBE, а комбинация HDM плюс TGF-β приводила к пролонгированной потере E-кадгерина в соединениях, в то время как только HDM не оказывал явного эффекта через 6 часов (рис.6д). Более того, мы наблюдали, что воздействие только HDM вызывало устойчивую делокализацию E-кадгерина в эпителии бронхиальной астмы (рис. 6e). В соответствии с эффектами 16HBE (фиг. 4a) и NHBE (не показано), HDM вызывал расщепление ZO-1 в эпителии астмы (фиг. 6f).

ОБСУЖДЕНИЕ

Эпителиальные соединения стали важными мишенями для аллергической сенсибилизации. Их распад может облегчать транспорт аллергенов, способствовать провоспалительным ответам эпителия 1 и обеспечивать доступ факторов роста к базолатеральным рецепторам 29.Это может служить нормальной реэпителизации, но также может способствовать аберрантному восстановлению и продолжающемуся ремоделированию тканей. Следовательно, эффективное восстановление плотных контактов при травме может иметь решающее значение у пациентов, страдающих аллергической астмой.

Ранее было описано, что HDM увеличивает проницаемость эпителия 30. Здесь мы показываем, что это может быть связано с временной потерей эпителиальных соединений, которая, вероятно, опосредована индуцированным HDM перераспределением соединительных белков, e.грамм. E-кадгерин и ZO-1, а также протеолитическая деградация белков плотных контактов с последующей быстрой локализацией этих молекул на мембране. Наши результаты также дают представление о лежащем в основе механизме: HDM индуцирует активацию EGFR сериновой протеазой / PAR2-зависимым образом, что является критическим для последующего временного нарушения межклеточных соединений. Как описано ранее, это может включать EGFR-индуцированное фосфорилирование тирозина и делокализацию соединительных белков, а также ослабленное перераспределение этих белков в эпителиальные соединения 31-35.Ингибирование EGFR уменьшало разборку эпителиальных соединений и последующую миграцию / распространение, а также улучшало восстановление барьерной функции как при повреждении, так и при ранении, индуцированном HDM. Кроме того, HDM влияет на целостность соединений посредством EGFR-независимых механизмов, вызывая расщепление ZO-1 и окклюдина. Ингибирование активности серинпептидазы не блокирует расщепление молекул TJ, что позволяет предположить участие других ферментативных активностей, содержащихся в HDM ( e.грамм. хитиназы) или индукцией межклеточных протеаз. Последний, вероятно, способствует деградации ZO-1, поскольку это внутриклеточный процесс. Интересно отметить, что хитины и микробные структуры глюкозы, присутствующие в экстракте HDM, могут активировать лектиновые рецепторы С-типа 36, вызывая потоки Ca ²⁺ 37, что может приводить к активации кальпаинов и последующему расщеплению соединительных белков 38. В соответствии с этим, аллергены HDM могут индуцировать приток Ca ²⁺ в эпителиальные клетки дыхательных путей 39.Хотя требуются дальнейшие исследования, мы наблюдали, что ионофор кальция индуцировал перераспределение и расщепление ZO-1 (данные не показаны).

Учитывая эффекты AG1478 на распределение E-cadherin, мы предположили, что устойчивая активность EGFR может нарушать функцию эпителиального барьера, поскольку считается, что слипчивые соединения обеспечивают архитектуру, необходимую для правильной сборки плотных соединений. Мы показали, что активность EGFR увеличивается / продлевается при предварительной обработке эпителиальных клеток TGF-β, фиброгенным цитокином с повышенными уровнями в астматических дыхательных путях 13.TGF-β, по-видимому, делает это за счет усиления экспрессии EGFR, а также частичного предотвращения лиганд-индуцированной деградации и эндоцитоза EGFR. В сочетании с этим, TGF-β усиливает индуцированную HDM передачу сигналов EGFR, что приводит к продолжающемуся индуцированному HDM контактному повреждению. Это может предложить возможное объяснение неадекватного восстановления функции эпителиального барьера, наблюдаемого при астме, когда воздействие HDM может происходить в присутствии повышенных уровней TGF-β 13. Последнее может быть связано с полиморфизмом промотора TGF-β, связанным с астмой. 40.Примечательно, что воздействие HDM модифицирует эффект однонуклеотидных полиморфизмов TGF- β на AHR у детей 41. Кроме того, повышенная активность EGFR может иметь отношение к астме, учитывая аберрантную активность / экспрессию EGFR, наблюдаемую в дыхательных путях при астме 13, 15. Важность аберрантная активность EGFR дополнительно подчеркивается полиморфизмом CA-повторов в гене EGFR, который связан как с наличием, так и с тяжестью астмы 42. Важно отметить, что наше исследование показывает, что HDM индуцирует длительную делокализацию E-кадгерина в эпителии астмы, указывая на то, что наши данные действительно могут иметь отношение к астме.Это дополнительно подтверждается нашими предварительными гистологическими данными у пациентов с астмой (данные не опубликованы), где мы наблюдали делокализацию E-кадгерина в бронхиальном эпителии. В будущих исследованиях мы стремимся провести более подробное сравнение между здоровыми людьми и людьми, страдающими астмой. Устойчивая потеря E-кадгерина в соединении при повышенной / продолжительной активации EGFR может иметь важные последствия, поскольку может способствовать ремоделированию эпителия, например, посредством ЕМТ 11. Кроме того, потеря эпителиальных соединений, вызванная TGF-β и HDM, может способствовать экспрессии факторов роста, а также проаллергических факторов 1, 16 эпителием дыхательных путей.Кроме того, нарушение барьера может способствовать воспалению дыхательных путей за счет активации эпителия цитокинами, высвобождаемыми воспалительными клетками в просвете дыхательных путей с рецепторами, ограниченными базолатеральной поверхностью эпителия.

В заключение, мы показали, что HDM вызывает временное снижение барьерной функции, которое поддерживается, когда передача сигналов EGFR облегчается, например. присутствием TGF-β. Таким образом, несмотря на облегчение миграции / распространения, усиление передачи сигналов EGFR может снижать целостность эпителия, нарушать восстановление эпителия и повышать уязвимость эпителия для HDM.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить S. Post (Лаборатория аллергологии и легочных заболеваний, Отделение патологии и медицинской биологии, Университетский медицинский центр Гронингена, Гронинген, Нидерланды) за выполнение анализа ферментативной активности экстракта клещей.

Сноски

• Заявление о поддержке

  Это исследование было поддержано грантом Нидерландского фонда астмы (IH Heijink, № 3.2.05.039) и грантами Канадского почечного фонда и Национального совета по научным и инженерным исследованиям Канады (А.Капус).

• Заявление о заинтересованности

  Не заявлено.

• Получено 6 августа 2009 г.
• Принято 15 марта 2010 г.

Передача сигналов рецептора эпидермального фактора роста способствует дисфункции эпителиального барьера, вызванной клещами домашней пыли

Рисунок 6–

Предварительная обработка трансформирующим фактором роста (TGF) -β продлевает вызванное домашним пылевым клещом (HDM) разрушение эпителиальных контактов. a, b) клетки 16HBE культивировали в LabTeks в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ), как указано, в присутствии и в отсутствие AG1478 (1 мкМ).a) E-кадгерин и b) zona occludens (ZO) -1 были обнаружены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Показаны представители трех независимых экспериментов. c) клетки 16HBE выращивали на покровных стеклах в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ⁻¹ ) в течение 6 ч. Электронно-микроскопический анализ плотных контактов проводился, как указано (белые стрелки). Показаны репрезентативные изображения, полученные с помощью электронной микроскопии.г) Клетки выращивали на массивах измерения импеданса электрических клеток и субстратов (ECIS) в дубликатах в течение 3 дней, лишали сыворотки в течение 4 часов, предварительно обрабатывали в течение ночи с TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ), а затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ) / носитель. Сопротивление измеряли через 0 и 8 часов после обработки HDM при 400 Гц с использованием ECIS. n = 6. *: p <0,05. Указаны средние значения. Нормальные первичные эпителиальные клетки бронхов, полученные из Lonza (Walkersville, MD, USA) e), и эпителиальные клетки, полученные из чистки бронхов при астме 16, выращивали до слияния в LabTeks в течение 3-5 дней, лишенные фактора роста / гормона в течение 4 часов до - обрабатывали в течение ночи TGF-β или без него (2 нг · мл ^-1 ) и затем стимулировали HDM (50 мкг · мл ^-1 ) или эпидермальным фактором роста, как указано.E-кадгерин и ZO-1 были обнаружены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Показаны представители трех независимых экспериментов. f) Полные клеточные лизаты получали из эпителиальных клеток бронхиальной астмы 16, и ZO-1 определяли вестерн-блоттингом (стрелка). Показаны представители трех независимых экспериментов.

Отключение XB130 связано как с прогнозом, так и с чувствительностью к химиотерапии рака желудка

Abstract

XB130 — это недавно охарактеризованный адаптерный белок, который, как сообщалось, способствует росту опухоли щитовидной железы, но его роль в прогрессировании других видов рака, таких как рак желудка (РЖ), остается неизвестной.Соответственно, мы исследовали связь между экспрессией XB130 и прогнозом пациентов с GC. Объектами исследования были 411 пациентов с ГК I – IV стадий. Экспрессию XB130 исследовали на хирургических образцах GC. Для оценки прогностической значимости XB130 для выживаемости и рецидивов использовались анализ Каплана-Мейера и модель пропорциональных рисков Кокса. Более того, GC-клетки, стабильно трансфицированные короткой шпильчатой ​​РНК XB130, были созданы для анализа влияния XB130 на чувствительность химиотерапии.Результаты показывают, что как мРНК XB130, так и экспрессия белка обнаруживались в нормальных тканях желудка. Общее время выживания пациентов со стадией IV и период без признаков заболевания после радикальной резекции ГК у пациентов со стадией I – III были значительно короче, когда иммуногистохимическое окрашивание на XB130 было низким, чем когда окрашивание было высоким (оба p <0,05). Экспрессия XB130 также предсказывала чувствительность опухоли к нескольким химиотерапевтическим агентам. Жизнеспособность как клеток SGC7901, подавляющих XB130, так и клеток дикого типа подавлялась 5-фторурацилом (5-ФУ), цисплатином и иринотеканом дозозависимым образом, но цисплатин и иринотекан были более чувствительны в отношении клеток GC, подавляющих sXB130, и 5-ФУ показал более высокую чувствительность к клеткам дикого типа.При лечении 5-ФУ пациенты с высокой экспрессией опухолей XB130 имели более высокую выживаемость, чем пациенты с опухолями с низкой экспрессией. Эти данные показывают, что снижение экспрессии белка XB130 является прогностическим биомаркером для более короткой выживаемости и более высокой частоты рецидивов у пациентов с ГК, а также для ответа на химиотерапию.

Образец цитирования: Shi M, Huang W, Lin L, Zheng D, Zuo Q, Wang L, et al. (2012) Отключение XB130 связано как с прогнозом, так и с химиочувствительностью рака желудка.PLoS ONE 7 (8):
e41660.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660

Редактор: Цзилонг ​​Вэнь,
Гонконгский университет науки и технологий, Китай

Поступила: 31.03.2012; Принято к печати: 24 июня 2012 г .; Опубликовано: 23 августа 2012 г.

Авторские права: © Shi et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национальной программы по проекту ключевых фундаментальных исследований (2012CB945100, WL и YL), Групповой программы Фонда естественных наук провинции Гуандун, Китай (S2011030003134, WL и YL) . Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Онкогены и антионкогены играют жизненно важную роль в развитии и прогрессировании рака желудка (РЖ), и было доказано, что генетическая гетерогенность заметно влияет на прогноз.Поэтому поиск новых генов и белков с потенциальной ценностью в качестве диагностических или прогностических инструментов важен, а нацеливание на новые онкогены — еще один многообещающий подход к терапии рака.

XB130 — это недавно идентифицированный адаптерный белок, который сильно экспрессируется в селезенке и щитовидной железе человека, но слабо экспрессируется в почках, головном мозге, легких и поджелудочной железе [1]. XB130 был обнаружен в фолликулярной и папиллярной карциноме щитовидной железы, а также в клеточных линиях карциномы легких человека [2].Хотя его экспрессия снижена при карциноме щитовидной железы, было обнаружено, что XB130 является промотором опухоли [2]. Сообщалось, что XB130 не только играет роль в пролиферации, выживании, подвижности и инвазии клеток [2], [3], [4], но также участвует в передаче сигналов [1]. XB130 регулируется Rac и цитоскелетом [3], и он участвует в активации c-Src [1] и пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) / Akt [4], которые, в свою очередь, регулируют цитоскелетная функция [3]. Эти сигнальные пути, как было показано, также играют важную роль в развитии и прогрессировании GC [5], [6], [7].Следовательно, XB130 тоже может играть роль в GC. Однако до сих пор в области гастроэнтерологии не проводилось исследований этого недавно открытого адапторного белка. В этом исследовании мы предположили, что экспрессия XB130 может быть связана с выживаемостью и / или рецидивом опухоли, а также с химиочувствительностью GC.

Результаты

Экспрессия XB130 в нормальных тканях желудка и GC

В отличие от предыдущих сообщений, мы подтвердили, что XB130 конститутивно экспрессируется в нормальных тканях печени, толстой кишки, селезенки и желудка человека (рис. 1а).Иммуногистохимия была проведена для оценки экспрессии XB130 во всех 411 парах залитых парафином срезов из GC и прилегающих к ним неопухолевых тканей. Мы обнаружили, что XB130 преимущественно экспрессируется в цитоплазме нормальной ткани желудка, тогда как в тканях GC он значительно снижается. Далее мы разделили GC на положительные XB130 (высокая экспрессия с баллом ≥3) и отрицательные (низкая экспрессия с баллом <3) по баллам окрашивания (рис. 1b). Частота положительных и отрицательных результатов XB130 на стадии I – III GC не различалась, но доля отрицательных результатов XB130 была выше на стадии IV и в группах послеоперационного рецидива (рис. 1c).Количественно определенный уровень мРНК XB130 был обнаружен в образцах паллиативной резекции стадии IV и значительно снижен в продвинутых ГК (рис. 1d). Точно так же снижение экспрессии белка XB130 в усовершенствованной GC также было подтверждено вестерн-блоттингом (рис. 1e).

Рисунок 1. Экспрессия белка или мРНК XB130 в тканях желудка.

( a ) Ген XB130 экспрессируется в печени, селезенке, толстой кишке и желудке человека. ( b ) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания белка XB130 в ткани GC и прилегающей неопухолевой ткани.( c ) Заболеваемость XB130-отрицательным и XB130-положительным GC на стадиях I – III (n = 263) и стадии IV (n = 148). ( d ) На стадии I – III GC после радикальной резекции экспрессия мРНК XB130 была значительно ниже в опухолевой ткани, чем в соответствующей соседней неопухолевой ткани, количественно оцененной с помощью флуоресцентной ПЦР (p <0,01, n = 9 на группу ) . ( e ) Экспрессия белка XB130 на стадиях I – III GC (T) значительно снижена по сравнению с экспрессией нормальной желудочной тканью (N) при вестерн-блоттинге ( p <0.01, n = 6 в группе). Образцы на (a), (d) и (e) были свежими тканями от пациентов с I – III стадией GC, которым была проведена радикальная резекция, в то время как образцы на (b) и (c) были от пациентов с I – IV стадией GC, поскольку описано в разделе о методах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660.g001

Низкая экспрессия XB130 коррелирует с плохим прогнозом

При анализе 411 случаев GC на стадии I – IV, совокупная выживаемость пациентов с отрицательным окрашиванием XB130 была значительно ниже, чем у пациентов с положительным окрашиванием (рис. 2a).У пациентов с IV стадией GC, которые потеряли возможность излечения хирургическим вмешательством, он показал значительно более низкую выживаемость в группе с отрицательным результатом XB130 (рис. 2b). Среднее время общей выживаемости пациентов на продвинутой стадии было больше в группе с положительной реакцией на XB130, чем в группе с отрицательной реакцией (16,7 против 8,5 месяцев, HR для отрицательной группы составлял 1,72, p = 0,011; Таблица 1). У тех пациентов на стадии I – III GC, которым была проведена радикальная операция по резекции, выживаемость без признаков заболевания в группе с положительной реакцией на XB130 была выше, чем в группе с отрицательной реакцией (p <0.05; Рисунок 2c), в то время как среднее время до рецидива составляло 36 и 24 месяца в положительных и отрицательных группах соответственно (таблица 1, HR для отрицательных пациентов составлял 1,2, p = 0,022). Эти данные показывают, что низкая экспрессия XB130 связана с более короткой выживаемостью и более частым рецидивом у пациентов с GC.

Рис. 2. Иммуноокрашивание, отрицательное по XB130, предсказывает плохой прогноз у пациентов с ГК.

( a ) У всех 411 пациентов с GC (стадии I – IV) кумулятивная выживаемость XB130-отрицательной группы была значительно ниже, чем у положительной группы ( p <0.0001). ( b ) У 148 пациентов с IV стадией GC у группы XB130-отрицательная кумулятивная выживаемость была значительно ниже, чем у положительной группы ( p = 0,01). ( c ) У пациентов с ГК I – III стадии, получавших радикальную резекцию, кумулятивная выживаемость без признаков заболевания была значительно ниже для XB130-отрицательной группы, чем для положительной ( p = 0,019).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660.g002

Прогностическая ценность других клинико-патологических параметров

Влияние других клинико-патологических параметров на общую выживаемость и выживаемость без признаков заболевания было указано в таблице 1 и на рисунке 3.Помимо XB130, результаты анализа функции выживаемости Каплана-Мейера у пациентов на IV стадии, сгруппированные по хорошо известным факторам, таким как концентрация карциноэмбрионального антигена (CEA), дифференциальная степень, метастазирование, асцит и химиотерапия, продемонстрировали значительное влияние на совокупную выживаемость ( Рис. 3 а – е). В однофакторном регрессионном анализе Кокса у пациентов, получавших радикальную терапию, мы отметили, что стадия также является значимым прогностическим фактором рецидива (Таблица 1).

Рисунок 3.Кривые выживаемости пациентов с раком желудка (РЖ) в больнице Нанфанг с клинико-патологическими факторами.

Цифры обозначены следующим образом: совокупная выживаемость пациентов с ГК с ( a ) карциноэмбриональным антигеном (CEA) ≤5 мкг / л или> 5 мкг / л, ( b ) различной степени дифференциации (разницы). , ( c ) с (M ₁ ) или без (M ₀ ) метастазов, ( d ) с асцитом или без него, ( e ) с химиотерапией или без нее.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660.g003

В многомерном анализе с использованием модели Кокса мы отметили, что XB130, CEA, химиотерапия и асцит (все p <0,01) были независимыми факторами для прогнозирования HR для смерть у пациентов на стадии IV, тогда как XB130 (p = 0,044) и стадия (p <0,000) были независимыми факторами для прогнозирования HR для рецидива после радикальной резекции GC у пациентов на стадии I – III (Таблица 2).

Чувствительность к химиотерапевтическим средствам в ответ на подавление XB130

Чтобы выяснить терапевтический потенциал в нацеливании на XB130, мы оценили жизнеспособность клеток sh-XB130 в ответ на 5-ФУ, цисплатин и иринотекан.Жизнеспособность клеток в sh-XB130 и группах дикого типа подавлялась всеми тремя химиотерапевтическими агентами дозозависимым образом. Соответственно, по сравнению с sh-XB130, контроль дикого типа показал более высокую чувствительность к 5-ФУ, что проявлялось значительно более низкой жизнеспособностью клеток (рис. 4a), тогда как цисплатин (рис. 4b) и иринотекан (рис. 4c) оказались более эффективными при sh- XB130, чем в контроле дикого типа.

Рисунок 4. Чувствительность культивируемых клеток SGC7901 к химиотерапевтическим агентам и терапевтический эффект 5-ФУ у пациентов с IV стадией ГК.

( a ) Клетки, подвергшиеся воздействию 5-ФУ, показали лучшую жизнеспособность в группе sh-XB130, чем в группе скремблирования (n = 3–4 при каждой концентрации в каждой группе). ( b ) Жизнеспособность клеток в группе sh-XB130 резко снижается при воздействии цисплатина (n = 5–10 при каждой концентрации в каждой группе). ( c ) Иринотекан также снижал жизнеспособность клеток в группе sh-XB130 (n = 3–4 при каждой концентрации в каждой группе). ^* p <0,05, ^† p <0.01, ^‡ p <0,001 по сравнению с клетками дикого типа при соответствующей концентрации. ( d ) XB130-отрицательные пациенты имели более низкую выживаемость при лечении 5-ФУ (Fu = 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660.g004

Анализ выживаемости у пациентов с ГК, получавших терапию 5-ФУ

В ретроспективном исследовании мы оценили терапию 5-ФУ у пациентов с IV стадией ГК, отсортированные по XB130 отрицательно и положительно. При лечении 5-ФУ пациенты с положительным окрашиванием XB130 имели более высокую выживаемость, чем группа с отрицательным результатом (рис. 4d).Соответственно, XB130-положительные при терапии 5-ФУ имели более длительное среднее время общей выживаемости (рис. 4d). Поскольку было немного пациентов, получавших цисплатин или иринотекан, влияние уровня экспрессии XB130 на клинические терапевтические эффекты в настоящем исследовании не сравнивалось.

Обсуждение

XB130 — это недавно клонированный адаптерный белок 130 кДа, который, как сообщается, преимущественно экспрессируется в тканях щитовидной железы и селезенки, подтвержденный методом Нозерн-блоттинга, и играет многофункциональную роль в выживании, пролиферации и инвазии клеток в опухоль щитовидной железы [2] , [3], [4], но экспрессия его мРНК и белка в других тканях не была подтверждена с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга или иммуногистохимии.В этой статье мы впервые представили доказательства того, что мРНК и белок XB130 также конститутивно экспрессируются в нормальной ткани желудка и относительно более низкая экспрессия в клетках GC. Эти результаты контрастируют с предыдущими сообщениями о том, что мРНК XB130 практически не обнаруживалась в других тканях, кроме щитовидной железы и селезенки [1], [4], отчасти потому, что для подтверждения использовали только Нозерн-блоттинг. Экспрессия XB130 снижена в опухоли щитовидной железы, но остается совершенно неясным, является ли XB130 прогностическим биомаркером других злокачественных опухолей, таких как рак желудка (РЖ) [2].Чтобы подтвердить, что XB130 принимает участие в прогрессировании GC, мы проанализировали выживаемость или рецидив у 411 пациентов с GC и отметили, что низкая экспрессия XB130 предсказывала более низкую выживаемость и более высокое рецидивирование. Кроме того, впервые была оценена химиотерапевтическая чувствительность на основе экспрессии XB130, а клеточные эксперименты и клиническое ретроспективное исследование показали, что подавление XB130 увеличивает лекарственную чувствительность к цисплатину и иринотекану и снижает чувствительность к 5-фторурацилу.

Учитывая канцерогенность, описанную в предыдущих отчетах [2], [8], [9], XB130 следует рассматривать как онкогенный, отличный от опухолевого белка, хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить, имеет ли это место также в случае GC. Тогда как объяснить клиническое значение нашего клинического наблюдения, что подавление XB130 предсказывает низкую общую выживаемость при поздних стадиях РЖ и более высокую частоту рецидивов у пациентов, получавших радикальную резекцию? Фактически, известно, что онкогенез может быть результатом изменений множества генов и белков, в то время как XB130, адаптерный белок с более чем одним функциональным доменом, может подвергаться влиянию множества вышестоящих и нижестоящих факторов.Следовательно, слишком рано судить о том, является ли ген или белок онкогенным или нет, основываясь только на его экспрессии в клинических образцах, хотя последние действительно намекали на некоторые подсказки. Фактически, подавление XB130 в GC можно рассматривать как компенсаторную корректировку, потому что некоторые опухолевые супрессоры будут мобилизованы, чтобы противостоять XB130 во время прогрессирования GC. Аналогичным образом сообщалось, что экспрессия опухолевого супрессора p53 была выше в низкодифференцированных GC, чем в хорошо дифференцированных [10], в то время как при раннем раке желудка с низким уровнем апоптоза повышенная экспрессия Bcl-2 и p53 была более вероятной. способствовать метастазированию [11], [12].

XB130 может быть протоонкогеном, который сохраняется в нормальной ткани. Такие протоонкогены могут способствовать поддержанию физических функций обновления клеток и миграции вверх в нормальном желудке. Между тем, существует еще один набор регулирующих генов, которые предотвращают чрезмерную пролиферацию нормальных клеток и метаплазию. Однако, как только микроэкологический баланс нарушается, пролиферация и метастазирование клеток выходят из-под контроля, что приводит к канцерогенезу [13]. Эта классическая теория протоонкогена может дать приемлемое объяснение, почему нормальная ткань с такой высокой экспрессией XB130 все еще остается «здоровой».Известно, что многие гены и сигнальные пути играют проонкогенную или антионкогенную роль в зависимости от контекста, поэтому нередко один и тот же ген может оказывать разное действие на разных стадиях или в разных тканях развития рака [ 14], [15], [16]. В настоящем исследовании, хотя мы не касались функций XB130 в нормальной ткани желудка, эта тема также интересна и требует дальнейших исследований.

Если паттерн экспрессии XB130 может служить суррогатным маркером, предсказывающим ответ на химиотерапию, он также может дать объяснение прогнозу.В настоящее время комбинированные схемы на основе производных фторпиримидина и соединений платины были приняты в качестве общепринятого лечения первой линии для ГК [17], в то время как иринотекан, ингибитор топоизомеразы I, используется в качестве лечения второй линии [18], а цисплатин имеет широко используется при лечении запущенных неоперабельных ГК [19]. В настоящем исследовании были проведены исследования химиотерапевтической чувствительности на основе уровня экспрессии XB130. В клетках GC нокдаун XB130 показал лучшую чувствительность к цисплатину и иринотекану, но с меньшей чувствительностью к 5-ФУ.Наши клинические данные показали более короткое общее время выживания у пациентов, получавших 5-ФУ, с низкой экспрессией XB130, что позволяет предположить, что подавление XB130 снижает чувствительность к 5-ФУ, что может быть еще одним объяснением плохого прогноза у пациентов с низкой экспрессией XB130. в этом исследовании. Наши открытия в клеточной линии GC предполагают, что в продвинутых GC, большинство из которых характеризуется низкой экспрессией XB130, могут получить больше пользы от цисплатина и иринотекана, кроме 5-FU. Учитывая гетерогенный геномный фон, такой как различная экспрессия XB130 в GC, возможно, что некоторые популяции могут получить пользу от иринотекана и / или цисплатина, как это было предложено в нашем клеточном эксперименте, и заслуживает дальнейшего изучения.Дальнейшие проспективные исследования могут определить, можно ли использовать паттерны экспрессии XB130, чтобы помочь стратифицировать пациентов в различных режимах мультимодального лечения.

Таким образом, наше настоящее исследование впервые предоставило первые доказательства существования XB130 в тканях желудка и GC. Мы подтвердили, что оценка химиотерапевтической чувствительности, основанная на экспрессии XB130, была направлена ​​в первую очередь, что указывает на то, что пациенты с низкой экспрессией XB130 могут быть чувствительны к цисплатину и иринотекану, однако требуются более серьезные доказательства.Клиническая перспектива этого исследования включает: (1) XB130 может действовать как прогностический биомаркер ГК из-за его низкой экспрессии, влияющей на неблагоприятные исходы; (2) Поскольку в нашем исследовании химиотерапевтической чувствительности ГК с низкой экспрессией XB130 лучше реагируют на цисплатин и иринотекан, чем на 5-фторурацил, оценка экспрессии XB130 может помочь в выборе клинических препаратов при ГК.

Материалы и методы

Пациенты и образцы тканей

Всем 411 пациентам был поставлен гистологический диагноз в больнице Наньфанг Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Гуандун, Китай) с 2000 по 2011 год.Стадия опухоли определялась в соответствии с 7-м изданием руководства AJCC по стадированию рака 2010 г. Образцы для диагностических целей были взяты с согласия каждого пациента. Исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом больницы Наньфанг Южного медицинского университета. Среднее время наблюдения для всех пациентов составило 59,5 (95% ДИ: от 55,5 до 63,5) месяцев. Клинические характеристики и экспрессия XB130 у всех пациентов с GC описаны в таблице 1. Пациентам с I – III стадией GC была выполнена радикальная резекция, а пациентам с IV стадией была выполнена паллиативная операция.

Перед проведением иммуногистохимического анализа образцы первичной ткани, залитые парафином, разрезали на срезы толщиной 4 мкм и помещали на предметные стекла. Девять пар опухолей и нормальных тканей, прилегающих к раку, от пациентов на стадии IV GC были случайным образом собраны для количественной ПЦР в реальном времени и шесть пар для анализа вестерн-блоттингом.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием системы Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) и кроличьих антител против XB130 (1 × 100; Abnove) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.Для оценки XB130 срез ткани полностью сканировали, чтобы выставить баллы. Интенсивность окрашивания оценивалась как 0 (отрицательное), 1 (слабое), 2 (среднее) или 3 (сильное). Степень окрашивания оценивалась как 0 (0%), 1 (1–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) или 4 (76–100%), в соответствии с процентным соотношением положительно окрашенных областей по отношению ко всей площади карциномы (или целому срезу для нормальных образцов). Сумма баллов интенсивности и степени окрашивания использовалась в качестве окончательных баллов окрашивания (0–7) для XB130.С целью оценки выживаемости опухоли с окончательной оценкой окрашивания ≥3 считались положительными. Иммуноокрашивание XB130 оценивалось независимо двумя людьми, не знавшими клинических параметров.

Количественная ПЦР флуоресценции

Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Затем была получена обратная транскрипция кДНК с помощью набора для синтеза кДНК iScript ™ (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя.Все данные по РНК были представлены относительно гена домашнего хозяйства β-актина с использованием метода ΔΔCt. Обычную ПЦР также проводили для исследования экспрессии XB130 в различных органах человека и мыши (последовательности праймеров в таблице S1).

Вестерн-блоттинг

Ткани дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали буфером для лизиса белка в течение 30 мин. Выполняли центрифугирование, и супернатант, содержащий белок, сохраняли. Белковые лизаты разделяли электрофоретически на 10% SDS-полиакриламидном геле и переносили на поливинилиденфторидные мембраны (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA).Затем проводили иммуноблоттинг с использованием кроличьих антител против XB130 (PradoWalnut, Калифорния, США) и β-актина (Санта-Крус, Калифорния). Иммунореактивные полосы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции (Amersham) с системой детектирования вестерн-блоттингом (Kodak Digital Science, Рочестер, Нью-Йорк, США) и количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image QuantityOne v4.6.2.

Клеточная культура

Клетки из клеточной линии SGC7901 культивировали в полной среде [среда 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Hyclone)].Стабильно трансфицированные клетки поддерживали в среде с присутствием пуромицина (Sigma-Aldrich). Клетки инкубировали при 5% CO ₂ при 37 ° C.

Создание стабильно трансфицированных клеточных линий

Три различные последовательности shРНК XB130 клонировали в плазмиду pSuper-Rretro-пуромицин с рестрикционным ферментом Bgl II, Hind III (New England Biolabs) и ДНК-лигазой T4 (Takara). Были сконструированы как pSuper-Rretro-puro-shXB130, так и pSuper-Rretro-puro. pSuper-Rretro-puromycin-shXB130 в сочетании с упаковывающим плазмидным вектором или скремблирующим вектором в качестве отрицательного контроля упаковывали в вирус с использованием кальций-фосфатного метода.Клетки SGC7901 трансфицировали плазмидами shRNA с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), повторяя трижды. Клетки культивировали, как указано выше, и отдельные колонии отбирали с помощью вестерн-блоттинга и количественной флуоресцентной ПЦР и использовали для дальнейших экспериментов. Были разработаны три shRNA, нацеленные на XB130, и один скрембл (таблица S2). Экспрессия как мРНК, так и белка XB130 (последовательность праймера в таблице S1, результаты экспрессии на фигуре S1A, B) подтверждали с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга.Эффективность аденовирусной инфекции показана на Рисунке S1C и D.

.

Анализ жизнеспособности клеток

Трипсинизировали и высевали на 96-луночные планшеты при начальной плотности 0,2 × 10 ⁴ / лунку, клетки культивировали и наблюдали через 1, 3, 5 и 7 день. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа метилтиазолилтетразолия (МТТ) в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение измеряли при 570 нм, при 655 нм в качестве эталонной длины волны. Все эксперименты проводили в трех экземплярах.

Оценка чувствительности к химиотерапевтическим средствам в GC-клетках

Клетки контроля дикого типа и sh-XB130 культивировали в среде с 5-фторурацилом (5-FU), цисплатином или иринотеканом в различных концентрациях. Сорок восемь часов спустя оценивали жизнеспособность клеток.

Статистический анализ

Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM или медианы. Использовались критерий хи-квадрат для категориальных переменных и t-критерий Стьюдента для непрерывных переменных. Выживаемость и частоту рецидивов рассчитывали по методу Каплана – Мейера.Статистическая значимость была принята при значении p менее 0,05.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Подтверждение эффекта сайленсинга генов малых шпилечных РНК XB130 (sh-XB130) и инфекционной эффективности аденовируса. Модели линии клеток с пониженной регуляцией XB130 были подтверждены с помощью ПЦР в реальном времени ( a ) и вестерн-блоттинга ( b ). Клетки, трансфицированные вектором скремблирования, служили отрицательным контролем, а нетрансфицированный MOCK — контролем.Инфекционная эффективность аденовируса в культивируемых клетках 293FT была подтверждена с помощью нормальной ( c ) и флуоресцентной ( d ) микроскопии. На вставке A — кривая усиления ПЦР в реальном времени.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041660.s001

(PPT)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: WL YL MS WH. Проведены эксперименты: MS WH LW NW YW. Проанализированы данные: YL WL LL DZ QZ LW YW NW. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: WL MS.Написал статью: YL LL WL.

Ссылки

1. 1.
   Xu J, Bai XH, Lodyga M, Han B, Xiao H и др. (2007) XB130, новый адаптерный белок для передачи сигнала. J Biol Chem 282: 16401–16412.
2. 2.
   Шиодзаки А., Лодыга М., Бай XH, Надесалингам Дж., Ояидзу Т. и др. (2011) XB130, новый адаптерный белок, способствует росту опухоли щитовидной железы. Am J Pathol 178: 391–401.
3. 3.
   Lodyga M, Bai XH, Kapus A, Liu M (2010) Адаптерный белок XB130 является Rac-контролируемым компонентом ламеллиподий, который регулирует подвижность и инвазию клеток.J Cell Sci 123: 4156–4169.
4. 4.
   Lodyga M, De Falco V, Bai XH, Kapus A, Melillo RM и др. (2009) XB130, тканеспецифический адаптерный белок, который связывает онкогенную киназу RET / PTC с путем PI 3-киназы. Онкоген 28: 937–949.
5. 5.
   McLachlan RW, Kraemer A, Helwani FM, Kovacs EM, Yap AS (2007) Адгезия E-кадгерина активирует передачу сигналов c-Src в межклеточных контактах. Mol Biol Cell 18: 3214–3223.
6. 6.
   Murai T, Miyauchi T, Yanagida T, Sako Y (2006) Регулируемая эпидермальным фактором роста активация Rac GTPase усиливает расщепление CD44 дезинтегрином металлопротеиназы ADAM10.Biochem J 395: 65–71.
7. 7.
   Пэ И.Х., Пак MJ, Юн С.Х., Кан С.В., Ли С.С. и др. (2006) Bcl-w способствует инвазии клеток рака желудка, индуцируя экспрессию матриксной металлопротеиназы-2 через фосфоинозитид-3-киназу, Akt и Sp1. Cancer Res 66: 4991–4995.
8. 8.
   Shiozaki A, Liu M (2011) Роль XB130, нового адаптивного белка, при раке. Дж. Клин Биоинформа 1: 10.
9. 9.
   Яманака Д., Акама Т., Фукусима Т., Недачи Т., Кавасаки С. и др. (2012) Фосфатидилинозитол-3-киназа-связывающий белок, PI3KAP / XB130, необходим для цАМФ-индуцированного усиления митогенной активности IGF в клетках щитовидной железы FRTL-5.Мол эндокринол 26: 1043–1055.
10. 10.
    Фэн Ч.В., Ван Л.Д., Цзяо Л.Х., Лю Б., Чжэн С. и др. (2002) Экспрессия р53, индуцибельной синтазы оксида азота и фактора роста эндотелия сосудов при предраковых и раковых поражениях желудка: корреляция с клиническими особенностями. BMC Cancer 2: 8.
11. 11.
    Pan W, Ishii H, Ebihara Y, Gobe G (2003) Прогностическое использование характеристик роста раннего рака желудка и паттернов экспрессии белков апоптоза, клеточной пролиферации и клеточной адгезии.J Surg Oncol 82: 104–110.
12. 12.
    Testino G, Gada D, De Iaco F, Cornaggia M (2002) экспрессия p53 и Ki-67 при эпителиальной дисплазии желудка и раке желудка. Panminerva Med 44: 369–371.
13. 13.
    Zhang J, Chen YH, Lu Q (2010) Проонкогенные и антионкогенные пути: возможности и проблемы терапии рака. Онколь будущего 6: 587–603.
14. 14.
    Косатц У., Малек Н.П. (2007) стр. 27: опухолевый супрессор и онкоген…? Cell Res 17: 832–833.
15. 15.
    Damm K (1993) ErbA: опухолевый супрессор превратился в онкоген? FASEB J 7: 904–909.
16. 16.
    Джонсон Д.Г. (2000) Парадокс E2F1: онкоген и ген-супрессор опухоли. Mol Carcinog 27: 151–157.
17. 17.
    Кос Ф. Т., Унку Д., Оздемир Н., Будакоглу Б., Одабас Х. и др. (2011) Сравнение схем цисплатин-5-фторурацил-фолиновая кислота и модифицированных схем доцетаксела-цисплатин-5-фторурацила при лечении первой линии метастатического рака желудка. Химиотерапия 57: 230–235.
18. 18.
    Takiuchi H (2011) Иринотекан неактивен в качестве препарата первой линии, но играет важную роль в лечении рака желудка. Рак желудка 14: 1–3.
19. 19.
    Montagnani F, Turrisi G, Marinozzi C, Aliberti C, Fiorentini G (2011) Эффективность и безопасность оксалиплатина по сравнению с цисплатином при запущенном, неоперабельном раке желудка: систематический обзор и метаанализ. Рак желудка 14: 50–55.

YAP / TAZ являются механорегуляторами передачи сигналов TGF-β-Smad и почечного фиброгенеза

Abstract

Как и многие органы, почка становится жесткой после травмы, и этот процесс все чаще признается важным фактором фиброгенеза.Да-ассоциированный белок (YAP) и коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим мотивом (TAZ) являются родственными механосенсорными белками, которые связываются с факторами транскрипции Smad, каноническими медиаторами профибротических ответов TGF- β . Здесь мы исследовали роль YAP / TAZ в зависимости жесткости матрикса ответов фибробластов на TGF- β . В отличие от роста на жесткой поверхности, рост фибробластов на мягком матриксе приводит к секвестрации YAP / TAZ в цитозоле и нарушению индуцированного TGF- β -индуцированного накопления Smad2 / 3 в ядре и транскрипционной активности.Нокдаун YAP или лечение вертепорфином, лекарством, которое недавно было идентифицировано как мощный ингибитор YAP, вызывало аналогичные изменения. Кроме того, вертепорфин снижает уровни YAP / TAZ и снижает общие клеточные уровни Smad2 / 3 после стимуляции TGF- β . Лечение вертепорфином мышей, подвергшихся односторонней обструкции мочеточника, аналогичным образом снижало уровни YAP / TAZ и накопление ядерного Smad в почках, а также ослабляло почечный фиброз. Наши данные предполагают, что повышение жесткости органов взаимодействует с TGF- β , чтобы индуцировать фиброз YAP / TAZ- и Smad2 / 3-зависимым образом.Вмешательство в эти перекрестные помехи YAP / TAZ и TGF- β / Smad, вероятно, лежит в основе антифибротической активности вертепорфина. Наконец, перепрофилировав клинически используемый препарат, мы проиллюстрировали терапевтический потенциал новой стратегии механоинтерференции, которая блокирует передачу сигналов TGF- β и почечный фиброгенез.

Ключевым этапом фиброгенеза является превращение покоящихся фибробластов в активные миофибробласты, которые откладывают внеклеточный матрикс (ЕСМ). ¹ TGF- β является основным фактором, управляющим процессом активации. ^2,3 Важным этапом в активации фибробластов, индуцированной TGF- β , является С-концевое фосфорилирование факторов профибротической транскрипции Smad2 и Smad3. Фосфорилированный Smad2 / 3 накапливается в ядре, где он управляет экспрессией TGF- β -чувствительных, профибротических генов. ⁴

После травмы критическим, но недостаточно распознаваемым изменением, которое происходит в почках и других органах, является повышение жесткости тканей. ^5–9 Множественные процессы, вызванные повреждениями, приводят к ожесточению органа, включая не только отложение рубцовой ткани, но также и повышенную экспрессию ферментов сшивания коллагена и эластина, которые укрепляют существующий ВКМ даже до появления рубца. ^7,8,10 Профибротический ответ фибробластов на TGF- β в высшей степени механочувствителен, при этом выживание, активация и экспрессия коллагена фибробластов зависят от жесткого ECM, напоминающего поврежденную фиброзную почку, но подавляемого мягкой здоровой почкой. как ECM. ^5,11–13 Однако, как фибробласты воспринимают и передают эти механические сигналы, в значительной степени оставалось загадкой.

Да-ассоциированный белок (YAP) и коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим мотивом (TAZ) являются кофакторами транскрипции, которые способствуют передаче сигнала TGF- β через , сохраняя активированный Smad2 / 3 в ядре. ^14–16 Активность YAP и TAZ определяется их локализацией в клетке: ядерный белок активен, а цитозольный белок неактивен. Недавно было показано, что локализация YAP / TAZ регулируется жесткостью ECM посредством модуляции напряжения цитоскелета. ¹⁷ В то время как YAP и TAZ локализуются в цитоплазме в клетках, выращенных на мягких, здоровых тканевых субстратах, ситуация, характеризующаяся пониженным натяжением цитоскелета, они локализуются в ядре клеток, выросших на жестких, поврежденных поверхностях. ^17,18 Эти данные позволили нам предположить, что YAP и TAZ могут быть критическими механотрансдукторами, которые связывают ощущение жесткости фибробластов с регуляцией ответов TGF- β при фиброзе почек.

Здесь мы показываем, что мягкий ECM ингибирует, а жесткий ECM усиливает индуцированную TGF- β передачу сигналов профибротического Smad, контролируя локализацию Smad2 / 3 в процессе, который опосредуется YAP и TAZ. Более того, лечение клеток и мышей вертепорфином, небольшой молекулой, используемой в течение многих лет для лечения глазных заболеваний с недавно описанной активностью ингибирования YAP, ¹⁹ блокирует индуцированную TGF- β активацию миофибробластов.Вертепорфин вызывал резкое снижение YAP и TAZ, которое было связано не только со снижением накопления в ядре Smad2 / 3, но также с уменьшением уровней Smad2 / 3 после стимуляции TGF- β . In vivo , вертепорфин снижал содержание интерстициального YAP / TAZ в почках, что сопровождалось снижением накопления Smad2 / 3 в ядрах и маркеров фиброза в почках. Взятые вместе, наши результаты определяют новый механочувствительный YAP / TAZ-зависимый путь, который регулирует индуцируемую TGF- β передачу сигналов Smad фибробластами.Кроме того, путем перепрофилирования клинически используемого низкомолекулярного ингибитора мы также описываем новый инструмент для вмешательства в механорегуляцию передачи сигналов TGF- β / Smad и в процессе определения новой многообещающей стратегии антифибротического лечения ХБП.

Результаты

TGF-

β — Индуцированная передача сигналов Smad регулируется жесткостью ECM

Хотя многочисленные исследования показали, что реакции фибробластов, индуцированные TGF- β , зависят от жесткости ECM, ^{5,11–13,20, 21} никто не исследовал, регулирует ли жесткость канонический профибротический сигнальный путь Smad.Поэтому мы исследовали влияние различий в жесткости ECM на различные события в пути Smad с использованием фибробластов, культивированных на покрытых фибронектином мягких (2 кПа) или жестких (100 кПа) субстратах.

TGF- β индуцировал эквивалентное и устойчивое фосфорилирование Smad2 и Smad3 как в мягких, так и в жестких фибробластах, культивируемых в геле (рисунок 1A, дополнительный рисунок 1). TGF- β также индуцировал устойчивое ядерное накопление Smad2 / 3 в фибробластах, выращенных на жестких гелях, при этом почти 100% клеток демонстрировали преимущественно ядерное окрашивание Smad2 / 3.Этот эффект, однако, был уменьшен в клетках, выращенных на мягких гелях, и только 40% стимулированных TGF- β клеток проявляли ядерный Smad2 / 3 (Рисунок 1B). Соответственно, индуцированная TGF- β транскрипционная активность Smad в фибробластах, выращенных на мягких гелях, была снижена в Smad-зависимом анализе репортерной люциферазы ^22,23 по сравнению с культурами жесткого субстрата (Рисунок 1C). Эти результаты показывают, что жесткость ECM контролирует субклеточную локализацию Smad2 / 3, не влияя на фосфорилирование Smad, опосредованное рецептором TGF- β .Взятые вместе, наши результаты подтверждают, что внутриклеточная локализация Smad2 / 3 и нижестоящая Smad-управляемая транскрипция регулируются механически.

Рисунок 1.

Жесткость субстрата модулирует TGF- β -индуцированную передачу сигналов Smad посредством регуляции внутриклеточной локализации Smad2 и Smad3. (A и B) крысиные фибробласты почек NRK49F, культивированные на мягких (2 кПа) и жестких (100 кПа) гелях, покрытых фибронектином, стимулировали TGF- β с последующим анализом (A) фосфорилирования Smad2 и (B) внутриклеточного Smad2 / 3 локализация.В A представлена ​​количественная оценка индуцированного TGF- β кратного увеличения фосфорилирования Smad2 ( n = 4 на условие). В B клетки контрастировали с DAPI для идентификации ядер ( n = 3 покровных стекла на условие). Стрелки указывают на клетки с преимущественно ядерным окрашиванием Smad2 / 3. Масштабная линейка, 20 мкм м. (C) Фибробласты, трансфицированные репортером люциферазы, связывающим Smad, и нормализующим контролем люциферазы Renilla, стимулировали TGF- β , и измеряли результирующую люминесценцию ( n = 6 на условие).Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица; P-Smad2, фосфо-Smad2. * P <0,05.

Локализация YAP и TAZ в фибробластах регулируется механически

Далее мы решили определить, как внутриклеточная локализация Smad2 / 3 зависит от жесткости ECM. YAP и TAZ являются кофакторами транскрипции, которые взаимодействуют и регулируют локализацию Smad2 / 3 в эмбриональных стволовых и эпителиальных клетках после стимуляции TGF- β . ^14,15 Интересно, что локализация YAP и TAZ в эпителиальных и эндотелиальных клетках также, как недавно было показано, регулируется жесткостью ECM. ^17,18,24,25 Чтобы установить, регулируется ли локализация YAP / TAZ аналогичным образом жесткостью ECM в фибробластах почек, мы создали покрытые фибронектином мягкие субстраты (2 кПа), имитирующие механизм нормальной почки ^26–28 и жесткие субстраты (100 кПа), соответствующие поврежденной фиброзной почке. ²⁹ Иммуноокрашивание на YAP / TAZ в почечных фибробластах, культивируемых на мягких и жестких гелях, показало диффузное окрашивание в клетках, выращенных на мягком матриксе, и преимущественно ядерное окрашивание в клетках, выращенных на жестком матриксе (дополнительный рисунок 2), подтверждая, что YAP и TAZ регулируются механически. в почечных фибробластах.

Вертепорфин ингибирует YAP и TAZ, в первую очередь, вызывая резкое снижение уровней YAP / TAZ

Поскольку известно, что YAP и TAZ способствуют передаче сигналов Smad, обнаружение того, что передача сигналов YAP / TAZ и профибротического TGF- β / Smad регулируется По жесткости почечных фибробластов мы предположили, что эти два пути могут быть связаны. Чтобы ответить на этот вопрос, мы стремились ингибировать YAP / TAZ в клетках, выращенных на жестких поверхностях, таких как покрытые фибронектином стекло и пластик, которые демонстрируют максимальную активацию YAP / TAZ, чтобы определить, будет ли блокада YAP / TAZ имитировать TGF- β. ингибирующее действие мягкой матрицы.

Вертепорфин представляет собой небольшую молекулу, которая в настоящее время клинически используется в качестве глазной фотодинамической терапии, действуя через зависимых от активных форм кислорода механизмов, не связанных с YAP / TAZ. ³⁰ Недавно было показано, что это лекарство в отсутствие световой активации обладает ранее неизвестной и очень сильной ингибирующей активностью YAP. ¹⁹ В этом сообщении было предложено, что вертепорфин опосредует это ингибирование, препятствуя способности YAP взаимодействовать с другими белками, вызывая конформационные изменения. ¹⁹ Однако неясно, является ли это доминирующим эффектом вертепорфина, и ингибирует ли вертепорфин также TAZ, близкородственный гомолог YAP, остается неизвестным.

Чтобы изучить влияние этого препарата на YAP и TAZ в фибробластах, мы обработали клетки NRK49F, выращенные на покрытых фибронектином пластиковых чашках, которые обеспечивают жесткую матричную среду, вертепорфином в присутствии или в отсутствие TGF- β . Поскольку контроль субклеточной локализации является основным регуляторным механизмом YAP / TAZ, мы сначала исследовали влияние вертепорфина на распределение YAP / TAZ в присутствии или в отсутствие TGF- β .Хотя вертепорфин не влиял на локализацию YAP / TAZ (рис. 2, A и B), он неожиданно вызывал резкое снижение уровней YAP / TAZ, что определялось иммунофлуоресцентным окрашиванием (рис. 2A) и иммуноблоттингом (рис. 2C). Вертепорфин также снижал уровни мРНК YAP / TAZ, предполагая, что снижение белка YAP / TAZ было отчасти из-за снижения синтеза (дополнительный рисунок 3). Хотя YAP и TAZ разлагаются протеасомой, ^31,32 протеасомное ингибирование с помощью MG132 не восстанавливает уровни белка YAP / TAZ после обработки вертепорфином, что позволяет предположить, что вертепорфин не усиливает протеасомную деградацию YAP / TAZ (дополнительная фигура 4).

Рисунок 2.

Лечение вертепорфином приводит к резкому снижению уровней YAP и TAZ. Фибробласты NRK49F обрабатывали вертепорфином 250 нмоль / л или без него в течение всего 12 часов. TGF- β (10 нг / мл) добавляли в течение указанного времени. В A после обработки вертепорфином и TGF- β , как описано выше, фибробласты NRK49F окрашивали антителом, направленным против YAP / TAZ (зеленый), и окрашивали DAPI (синий) для идентификации ядер. Показаны репрезентативные изображения, показывающие потерю окрашивания YAP / TAZ целыми клетками даже до стимуляции TGF- β , но без изменения преимущественно ядерной локализации YAP / TAZ.Масштабная линейка, 15 мкм м. (B) Процент клеток с преимущественно ядерным YAP / TAZ-окрашиванием определяли количественно в каждый момент времени. Подсчитывали минимум 50 клеток на повтор (четыре повтора на условие). В C после обработки вертепорфином и TGF- β лизаты подвергали иммуноблоттингу на YAP, TAZ и GAPDH. Репрезентативные блоты показаны на C, а также показаны количественные оценки относительных уровней (D) YAP ( n = 3 на условие) и (E) TAZ ( n = 5 на условие).Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица; ВП, вертепорфин. * P <0,05.

В соответствии с его способностью подавлять YAP / TAZ, лечение вертепорфином приводило к потере обнаруживаемых взаимодействий между YAP / TAZ и TEAD1, известным партнером по связыванию YAP / TAZ (дополнительные рисунки 5, A и C). Аналогичным образом, хотя TGF- β индуцировал резкое увеличение ядерных взаимодействий YAP / TAZ-Smad2 / 3 в клетках NRK49F, выращенных на стекле, покрытом фибронектином, этот эффект ослаблялся вертепорфином (дополнительные рисунки 5, B и D).Взятые вместе, наши результаты подтверждают, что в фибробластах вертепорфин ингибирует YAP и TAZ в первую очередь за счет уменьшения их количества, тем самым блокируя образование комплексов с транскрипционными партнерами, такими как TEAD1 и Smad2 / 3.

Индуцированное вертепорфином снижение YAP / TAZ подавляет передачу сигналов TGF-

β за счет уменьшения накопления ядер и общего количества активированных Smads

Показав, что вертепорфин вызывает потерю YAP / TAZ, мы затем исследовали эффекты этого препарата. на TGF- β -индуцированную передачу сигналов Smad.Лечение вертепорфином не влияло на индуцированное TGF- β быстрое фосфорилирование Smad2 или Smad3, поскольку уровни фосфо-Smad2 и фосфо-Smad3 увеличивались соответствующим образом в течение 30 минут после стимуляции TGF- β , даже при 12 часах лечения вертепорфином. (Рисунок 3A). После фосфорилирования активированный Smad2 / 3 накапливается в ядре, эффект, которому способствует YAP / TAZ-обеспечиваемое ядерное удержание Smad2 / 3. Как и ожидалось, снижение YAP / TAZ, вызванное 12-часовым лечением вертепорфином, нарушало стимулированное TGF- β накопление ядер Smad (рис. 3, B и C).Интересно, что помимо этого эффекта на накопление в ядре, лечение вертепорфином также снижает общий клеточный белок Smad2 и Smad3. Этот эффект был умеренным в отсутствие TGF- β , ситуации, в которой Smad2 / 3 в основном неактивен (рис. 3, B и D). Однако индуцированное вертепорфином снижение Smad2 / 3 было особенно усилено после активации Smad, индуцированной TGF- β , особенно в более поздние моменты времени (2, 4 и 8 часов после TGF- β ) (Рисунок 3, Б и Г).Поскольку TGF- β -активированные Smads в конечном итоге нацелены на расщепление протеасомами, ^33,34 мы затем проверили, опосредовано ли позднее снижение TGF- β -активированных Smads, индуцированное вертепорфином, усиленной протеасомной деградацией. Протеасомное ингибирование с помощью MG132 частично блокировало индуцированное вертепорфином снижение Smad2 и Smad3, которое происходит после стимуляции TGF- β , предполагая, что вертепорфин действительно усиливает протеасомную деградацию активированных Smad2 и Smad3 в этом контексте (дополнительный рисунок 6).

Рисунок 3. Обработка

вертепорфином нарушает TGF- β -индуцированную передачу сигналов Smad2 / 3 через , снижая накопление в ядре и общие уровни белка Smad2 / 3. (A) Почечные фибробласты NRK49F, выращенные в пластиковых чашках, покрытых фибронектином, обрабатывали вертепорфином 250 нмоль / л и без него в течение 12 часов и стимулировали TGF- β или без него в течение 30 минут. Лизаты подвергали иммуноблоттингу на фосфо-Smad2, фосфо-Smad3, Smad2 или Smad3. Показанные блоты являются репрезентативными для трех повторов.(B) Фибробласты NRK49F, выращенные на покровных стеклах, покрытых фибронектином, обрабатывали вертепорфином 250 нмоль / л или без него в течение всего 12 часов и 10 нг / мл TGF- β в течение указанного времени. Клетки окрашивали антителом против Smad2 (красный) и контрастировали DAPI (синий) для идентификации ядер. Репрезентативные изображения демонстрируют не только сниженное накопление в ядрах Smad2, начиная с раннего пост-TGF- β (0,5–1 час), но также и сниженные уровни Smad2 в цельных клетках в более поздние моменты времени (2, 4 и 8 часов).Масштабная линейка, 15 мкм м. (C) Процент клеток с преимущественно ядерным окрашиванием Smad2 определяли количественно в каждый момент времени. Подсчитывали минимум 50 клеток на повтор (четыре повтора на условие). Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. * P <0,05. В D фибробласты NRK49F, выращенные на пластике, покрытом фибронектином, обрабатывали 250 нмоль / л вертепорфина в общей сложности 12 часов и 10 нг / мл TGF- β в течение указанного времени.Лечение вертепорфином привело к резкому снижению Smad2 и Smad3 после TGF- β , в условиях, когда Smad2 и Smad3 находятся в основном в активированном состоянии. P-Smad2, фосфо-Smad2; P-Smad3, фосфо-Smad3; ВП, вертепорфин.

В соответствии с его ингибирующими эффектами Smad, обработка вертепорфином фибробластов NRK49F значительно ослабляла поздние события передачи сигналов TGF- β , такие как индуцированная TGF- β транскрипционная активность Smad3 (рис. 4A) и эндогенная экспрессия Smad-индуцируемых генов. (Рисунок 4, Б – Г).siRNA-опосредованный нокдаун YAP аналогичным образом ингибировал индуцированную TGF- β транскрипционную активность Smad, измеренную с помощью репортерной системы люциферазы, а также эндогенную экспрессию генов-мишеней Smad, что позволяет предположить, что Smad-ингибирующие эффекты вертепорфина опосредованы, по крайней мере, в часть через YAP (рисунок 5).

Рисунок 4. Обработка

вертепорфином ослабляет TGF- β / Smad-индуцированную экспрессию профибротического гена. (A) Фибробласты NRK49F, выращенные в пластиковых чашках, покрытых фибронектином, трансфицировали люциферазным репортером Firefly, управляемым четырьмя тандемными Smad-связывающими элементами, а затем обрабатывали вертепорфином 250 нмоль / л или без него в течение 4 часов с последующим добавлением 10 нг / мл TGF- β в течение 20 часов.Через 24 часа после трансфекции Smad3-зависимую транскрипцию оценивали с использованием Smad-зависимого анализа репортерной активности люциферазы ( n = 3 повтора на условие). (B – D) Клетки NRK49F обрабатывали вертепорфином 250 нмоль / л или без него в течение 2 часов с последующей стимуляцией TGF- β или без него в течение 24 часов. Уровни мРНК (B) COL3A1 , (C) COL4A1 и (D) ACTA2 , нормированные на GAPDH , измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР.Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица. * P <0,05.

Рисунок 5. Молчание

YAP ингибирует индуцированное TGF- β / Smad увеличение экспрессии профибротических генов. Почечные фибробласты NRK49F трансфицировали миРНК, направленной против YAP, или скремблированной миРНК. (A) Через 48 часов после трансфекции нокдаун YAP был подтвержден с помощью количественной ОТ-ПЦР . Эффекты нокдауна YAP на индуцированную TGF- β Smad-зависимую транскрипцию оценивали (B) с использованием Smad-зависимого анализа репортерной активности люциферазы и с помощью измерения уровней эндогенной мРНК TGF- β / Smad– индуцибельные гены (C) COL1A1 , (D) ACTA2 и (E) PAI1 .Результаты представляют n = 3 независимых повтора для каждого условия. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица; Скр, зашифровано. * P <0,05.

При фиброзном поражении почек вертепорфин вызывает снижение YAP / TAZ

In vivo

Чтобы изучить in vivo релевантности наших результатов, мы сначала исследовали влияние фиброзного повреждения на локализацию YAP / TAZ в интерстициальных фибробластах. , сравнивая почки мышей, перенесших (левостороннюю) одностороннюю обструкцию мочеточника (UUO), с почками, перенесшими фиктивную операцию.Через семь дней после обструктивного повреждения, во время развития фиброза, мы окрашивали серийно вырезанные срезы левой почки на маркер миофибробластов α –актин гладких мышц ( α -SMA) и YAP / TAZ. В поврежденных почках мышей UUO интерстициальные миофибробласты α –SMA ⁺ показали ядерное окрашивание YAP / TAZ (фиг. 6, A и B). Напротив, здоровые мягкие почки из контрольной группы с ложной операцией, которые были исследованы аналогичным образом, показали только редкие α -SMA ⁺ клетки, ни одна из которых не показала ядерный YAP / TAZ (Фиг.6, A и B).Поскольку только редкие интерстициальные фибробласты в здоровой почке экспрессируют α -SMA, мы также количественно определили процент клеток в интерстиции (расположение покоящихся фибробластов) с ядерным YAP / TAZ-окрашиванием в здоровых и поврежденных почках, обнаружив, что примерно 15% из всех интерстициальных клеток в почках с обструкцией и отсутствия интерстициальных клеток в здоровых почках экспрессируется ядерный YAP / TAZ (фигура 6C).

Рисунок 6.

Лечение вертепорфином приводит к снижению уровней YAP и TAZ в поврежденных, фиброзирующих почках.(A) Мышей, перенесших UUO ( n = 4) или фиктивную операцию ( n = 3), умерщвляли через 7 дней после процедуры. Показаны репрезентативные изображения серийно вырезанных срезов, иммуноокрашенных для (левые панели) α -SMA и (правые панели) YAP / TAZ из (верхние панели) ложнооперированной почки и (нижние панели) заблокированной почки. Белые стрелки указывают на серийно разрезанные интерстициальные клетки α -SMA ⁺ , а черные стрелки указывают на серийно разрезанные интерстициальные клетки. В почках UUO клетки α -SMA ⁺ часто проявляли ядерное окрашивание YAP / TAZ.В ложно оперированных почках не было обнаружено серийно разрезанных интерстициальных клеток, окрашенных как на α -SMA, так и на YAP / TAZ. Масштабная линейка, 80 мкм м. (B) количество кортикальных α -SMA ⁺ клеток и (C) процент интерстициальных клеток коры с ядерным YAP / TAZ окрашиванием были определены количественно; т испытание. В D мышей UUO лечили ( n = 7) или без вертепорфина ( n = 9), начиная сразу после операции, с ложнооперированными мышами в качестве контроля ( n = 6).Семь дней спустя у мышей, получавших вертепорфин, наблюдали снижение интерстициального окрашивания YAP / TAZ. Черные стрелки обозначают интерстициальные клетки, окрашенные YAP / TAZ. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица; ВП, вертепорфин. Масштабная линейка, 40 мкм м. * P <0,05.

Затем мы проверили, будет ли обработка вертепорфином мышей UUO вызывать почечные ингибирующие эффекты YAP / TAZ и Smad, аналогичные тем, которые мы наблюдали in vitro в культивируемых фибробластах почек.Вертепорфин значительно снижал интерстициальное окрашивание YAP / TAZ у мышей UUO, что согласуется с нашими данными in vitro (рис. 6D). Кроме того, при закупорке почек наблюдалось значительное увеличение интерстициального окрашивания α -SMA и накопления Smad2 / 3 в ядрах по сравнению с ложнооперированными почками — феномен, который не наблюдался при снижении уровней YAP / TAZ при лечении вертепорфином (дополнительная фигура 7). .

Вертепорфин подавляет почечный фиброгенез

In vivo

Учитывая его способность подавлять уровни YAP / TAZ и активацию Smad в поврежденных почках мышей UUO, мы затем проверили, предотвращает ли вертепорфин почечный фиброгенез.Мышей, перенесших UUO, рандомизировали для немедленного лечения вертепорфином или носителем (рис. 7A). В соответствии с ингибирующим действием на передачу сигналов TGF- β / Smad фибробластами почек, вертепорфин приводил к меньшему количеству миофибробластов α -SMA ⁺ через 7 дней после UUO (рис. 7B), уменьшая отложение интерстициального коллагена (рис. 7, C и D). ) и снижение интерстициальной экспрессии CTGF , известного TGF– β / Smad-индуцибельного гена (рис. 7E).

Рисунок 7.

Вертепорфин значительно снижает фиброз почек и накопление миофибробластов после УУО. (A) Мышей, перенесших левостороннюю UUO, рандомизировали для лечения вертепорфином ( n = 7) или носителем ( n = 9) сразу после операции. Мыши с ложной операцией служили здоровым контролем ( n = 6). Залитые в парафин срезы ткани почек мышей UUO, обработанных вертепорфином, окрашивали (B) антителом α -SMA для идентификации интерстициальных миофибробластов, (C) пикросириусом красным (PSR) для идентификации фибриллярного коллагена и (D) типом 4 антитело к коллагену (Col IV).Показаны репрезентативные изображения из различных групп лечения. Целые срезы почек (за исключением почечной лоханки) были подвергнуты цифровому анализу на предмет положительного окрашивания. Масштабная линейка, 150 мкм м. * P <0,05. (E) Залитые парафином срезы ткани почек инкубировали с дигоксигенин-конъюгированным зондом, специфичным для мРНК CTGF . Окрашивание в синий цвет означает положительное окрашивание рибозонда. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher.AU, условная единица; ВП, вертепорфин. Масштабная линейка, 20 мкм м.

Затем мы проверили, подавляет ли вертепорфин прогрессирование установленного фиброза. Через семь дней после UUO, в момент, когда фиброз уже развился, мышей рандомизировали для получения внутрибрюшинных инъекций вертепорфина или носителя в течение 1 недели (фиг. 8A). Через четырнадцать дней после UUO в почках с обструкцией почек мышей, получавших вертепорфин, снова было меньше α –SMA ⁺ миофибробластов (фигура 8B), меньше фиброза (фигура 8C) и уменьшена интерстициальная экспрессия CTGF (фигура 8D).Взятые вместе, наши результаты показывают, что вертепорфин не только снижает de novo фиброгенез в поврежденной почке, но также предотвращает прогрессирование установленного фиброза. Более того, наши находки также подтверждают ранее нераспознанное перекрестное взаимодействие между YAP / TAZ- и Smad-зависимыми путями, которое модулирует TGF- β -управляемый фиброгенез.

Рисунок 8.

Вертепорфин останавливает дополнительное прогрессирование установленного почечного фиброза после UUO. (A) Мышей, перенесших левостороннюю UUO, лечили вертепорфином ( n = 10) или носителем ( n = 7), начиная с 7 дней после операции.Мыши с ложной операцией служили здоровым контролем ( n = 4). Залитые в парафин срезы ткани почек мышей UUO, обработанных вертепорфином, окрашивали (B) антителом α -SMA для идентификации интерстициальных миофибробластов и (C) пикросириусом красным (PSR) для идентификации фибриллярного коллагена. Обработка вертепорфином ослабляла индуцированное UUO увеличение α -SMA и окрашивание фибриллярного коллагена. Показаны репрезентативные изображения из различных групп лечения. Целые срезы почек (за исключением почечной лоханки) были подвергнуты цифровому анализу на предмет положительного окрашивания.Масштабная линейка, 50 мкм м. (D) Залитые в парафин срезы ткани почек инкубировали с дигоксигенин-конъюгированным зондом, специфичным для мРНК CTGF . Окрашивание в синий цвет означает положительное окрашивание рибозонда. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с наименьшим значимым различием post hoc Fisher. AU, условная единица; ВП, вертепорфин. Масштабная линейка, 20 мкм м. * P <0,05.

Обсуждение

Хотя недавние исследования показали, что на фибробласты влияет жесткость ткани, ^{5,11–13,20,21} лежащие в основе механорегуляторные пути изучены плохо.Мы впервые показали, что индуцированная TGF- β каноническая передача сигналов Smad2 / 3 регулируется с помощью жесткости ECM посредством контроля локализации Smad2 / 3 и что эта механорегуляция может зависеть от белков YAP и TAZ. Мы также показываем, что вертепорфин, небольшая молекула, одобренная для лечения глазных сосудистых заболеваний с недавно описанными YAP / TAZ-ингибирующими свойствами, может блокировать не только индуцированную TGF- β передачу сигналов Smad2 / 3 в культивируемых фибробластах почек, но также и прогрессирование почечного фиброза in vivo .Вертепорфин опосредует свои антифибротические эффекты с помощью нескольких механизмов, в конечном итоге вмешиваясь в профибротические перекрестные помехи YAP / TAZ-TGF– β / Smad в почечных фибробластах.

На сегодняшний день было показано, что мягкий матрикс ингибирует переход фибробласт-миофибробласт в основном через TGF- β -независимые пути, такие как через регуляцию циклооксигеназы-2 ³⁵ и активность Rho / ROCK / мегакариобластного лейкоза 1. ^11,12 Эти TGF- β -независимые механорегуляторные пути фибробластов могут действовать согласованно с TGF- β , но механизмы, лежащие в основе этой механохимической синергии, остаются плохо определенными.В этой работе мы устанавливаем механистическую связь между жесткостью матрикса, YAP / TAZ и передачей сигналов Smad2 / 3 в регуляции ответов фибробластов на TGF- β . Этот эффект согласуется с предшествующими доказательствами физических взаимодействий между YAP / TAZ и Smad2 / 3 в ядре, ^14–16 , и он согласуется с сообщениями нашей группы и других, указывающих, что YAP и TAZ проявляют профибротическую активность. ^35–37 Действительно, Speight et al. ²⁴ ранее показали роль TAZ в контроле экспрессии α -SMA в поврежденном эпителии как часть эпителиально-миофибробластного перехода. ³⁵ Аналогичным образом недавние сообщения показали, что жесткая среда способствует YAP / TAZ-зависимой активации фибробластов и звездчатых клеток печени, способствуя синтезу матрикса независимо от TGF- β , возможно, за счет индукции CTGF и PAI1 . ^35,37 Взятые вместе, эти сообщения согласуются с нашими результатами, предполагая, что YAP и TAZ являются критическими механочувствительными медиаторами TGF- β -зависимого и -независимого фиброгенеза.

Признавая важность YAP и TAZ, мы определили вертепорфин как новый мощный ингибитор экспериментального фиброза. Хотя предыдущий отчет показал, что вертепорфин вызывает конформационное изменение YAP, которое влияет на его связывание с другими белками, ¹⁹ наши данные показывают, что доминирующим действием этого препарата на YAP и TAZ в фибробластах является резкое снижение абсолютных уровней эти два белка. Мы показываем, что вертепорфин снижает уровни мРНК YAP и TAZ, предполагая, что снижение синтеза YAP и TAZ может, по крайней мере, частично объяснить наши результаты.Однако, поскольку в недавних сообщениях было высказано предположение, что вертепорфин может также вызывать агрегацию белка за счет окислительного сшивания и усиленного разложения, ^38,39 другие эффекты этого препарата также могут играть роль.

В дополнение к своим эффектам на YAP и TAZ, вертепорфин оказывал множественные эффекты на профибротические белки Smad2 и Smad3. Профибротическая активность Smad2 / 3 регулируется на нескольких уровнях с активацией, опосредованной С-концевым фосфорилированием и последующим ядерным накоплением, и инактивацией, опосредованной дефосфорилированием, ядерным экспортом и деградацией. ^2,3 Хотя вертепорфин не влияет на индуцированное TGF- β фосфорилирование Smad2 / 3, он действительно ингибирует последующее ядерное накопление Smad (Figure 3). Этот эффект, вероятно, был вызван снижением функционального белка YAP / TAZ, поскольку известно, что YAP и TAZ действуют как факторы удерживания ядра Smad. ¹⁵ Интересно, что мы также отметили, что вертепорфин снижает количество Smad2 и Smad3 в фибробластах, вызывая лишь небольшое снижение само по себе, но гораздо более резкое подавление при совпадении с TGF- β (Рисунок 3).Белки, содержащие домен WW, такие как YAP и TAZ, конкурируют с убиквитинлигазами Smad за доступ к активированным ядерным Smads после стимуляции TGF- β . ^40,41 Следовательно, возможно, что индуцированное вертепорфином уменьшение белка YAP / TAZ могло усиливать убиквитинирование и деградацию TGF- β -активированных ядерных Smads. В соответствии с этой гипотезой мы показали, что протеасомное ингибирование частично компенсирует потерю Smads, вызванную совпадением с TGF- β и вертепорфином (дополнительная фигура 6).Однако недавние сообщения также предполагают, что вертепорфин может непосредственно усиливать деградацию определенных белков посредством окислительного сшивания и олигомеризации. ^38,39 Таким образом, вертепорфин может снижать уровни Smad2 / 3 посредством множественных механизмов, некоторые из которых, вероятно, зависят от YAP / TAZ, тогда как другие могут быть независимыми от YAP / TAZ.

Признавая множество потенциальных механизмов, с помощью которых вертепорфин может изменять YAP / TAZ- и Smad-зависимую передачу сигналов, мы использовали генетический подход, чтобы подтвердить важность перекрестных помех YAP / TAZ и TGF- β / Smad в регуляции фиброгенеза. .В этих экспериментах мы показали, что siRNA-опосредованный нокдаун YAP реципрокировал эффекты вертепорфина, поскольку обе стратегии уменьшали индуцированную TGF- β транскрипционную активность Smad и экспрессию классических профибротических генов в культивируемых фибробластах. Взятые вместе, наши результаты предполагают, что перекрестные помехи между этими двумя путями оказывают важные регулирующие эффекты на активацию фибробластов и продукцию ECM. Интересно, что эффекты молчания YAP не были столь значительными, как эффекты вертепорфина, это указывает на то, что вертепорфин может также опосредовать свои эффекты посредством др. Не-YAP-зависимых механизмов.В самом деле, хотя предыдущие исследования в основном были сосредоточены на профибротической активности YAP, ^36,37 , возможно, например, что вызванное вертепорфином снижение TAZ также может иметь важные эффекты.

Продемонстрировав эти новые эффекты вертепорфина в культивируемых почечных фибробластах, мы затем расширили наши результаты in vitro на модель на мышиной модели почечного фиброза. В этих исследованиях мы показали, что лечение вертепорфином мышей UUO снижает уровни YAP / TAZ и накопление ядер Smad в поврежденной почке наряду с экспрессией профибротических TGF- β / Smad-индуцибельных генов, таких как ACTA2 , COL3A1 , COL4A1 и CTGF .Хотя экспрессия этих Smad-индуцибельных генов регулируется другими факторами, кроме Smads, ^23,42,43 , взятых вместе, эти данные предполагают, что вертепорфин мешает профибротическому перекрестному взаимодействию YAP / TAZ-Smad2 / 3 in vitro в культивируемых фибробласты и in vivo в поврежденной почке мыши, тем самым подавляя фиброгенез.

Классически считающиеся мишенями пути Hippo, YAP и TAZ регулируются фосфорилированием сериновых остатков, которые контролируют не только их внутриклеточную локализацию, но также их убиквитинирование и последующую деградацию. ^31,32 В 2011 году Dupont et al. ¹⁷ показали, что жесткость матрикса является дополнительным регулятором этих двух белков. Механизмы, лежащие в основе этой механорегуляции, остаются неясными, хотя и Hippo-зависимые ^44,45 и Hippo-независимые ^17,18 пути, вероятно, вносят свой вклад. Регулируется ли активность пути фибробластов Hippo жесткостью матрикса или лечением вертепорфином, остается открытым вопросом, который требует дополнительных исследований.

Независимо от этих продолжающихся механистических исследований, наш вывод о том, что вертепорфин является мощным ингибитором почечного фиброгенеза, представляет собой захватывающий прогресс.Не существует специфических, безопасных и эффективных методов лечения почечной антифиброзной терапии, несмотря на центральную роль, которую рубцевание играет в прогрессировании почти всех форм ХБП. ⁴⁶ Ключевым препятствием на пути разработки эффективных антифибротических методов лечения является сложность и избыточность сети передачи сигналов о профиброте. Недооцененным фактором этой сложности является синергетическое взаимодействие, которое существует между биомеханическими и биохимическими регуляторными сигналами фиброгенеза. Нацеливаясь как на классический Smad2 / 3, так и на новый механочувствительный профибротический сигнал YAP / TAZ, мы определяем, используя перепрофилированное лекарство, новую фармакологическую стратегию, которая нарушает эту механохимическую синергию, тем самым ингибируя передачу сигналов профибротического TGF– β и ослабляя почечный фиброгенез.

Краткие методы

Подробные методы можно найти в дополнительных материалах.

Подготовка полиакриламида и силиконового геля

Стеклянные покровные стекла покрывали 2-кПа (мягкий) или 100-кПа (жесткий) полиакриламидным или силиконовым гелем с использованием модифицированных версий опубликованных протоколов. ^47–49 Гели покрывали стерильным фибронектином (10 мк г / мл; YO Proteins AB, Худдинге, Швеция) для создания однородного тонкого слоя белка ЕСМ для клеточной адгезии.

Культура клеток и лечение

Иммортализованные нормальные интерстициальные фибробласты почек крысы (NRK49F) и первичные дермальные фибробласты человека были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния) и Lonza (Миссиссауга, Онтарио, Канада) соответственно.После ночной депривации сыворотки (DMEM и 1% FBS) клетки стимулировали TGF- β (10 нг / мл; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) и / или вертепорфином (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) для указанное время.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и иммуноблоттинг

Фибробласты NRK49F, культивированные на покрытых фибронектином стеклянных покровных стеклах, иммуноокрашивали антителами, направленными против YAP / TAZ, Smad2 или Smad2 / 3. После добавления соответствующих вторичных антител выполняли контрастное окрашивание ядер DAPI.Были получены конфокальные микроскопические изображения, и процент клеток с преимущественно ядерным YAP / TAZ или Smad2 / 3 был рассчитан с использованием модифицированного опубликованного протокола. ²² Лизаты клеток NRK49F, выращенных в покрытых фибронектином чашках, подвергали блоттингу со следующими первичными антителами: Smad2, Smad3, Smad2 / 3, фосфо-Smad2, фосфо-Smad3, YAP / TAZ, α -тубулин, GAPDH или β -актин. Количественный анализ интенсивности полос проводили с использованием ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд).

Количественная ОТ-ПЦР

После обработки, описанной выше, РНК была собрана из клеток NRK49F и подвергнута обратной транскрипции, а количественная ОТ-ПЦР была проведена для анализа различий в уровнях мРНК ACTA2, COL1A1, COL3A1, COL4A1, GAPDH, PAI1. , ЯП и ТАЗ. Последовательности праймеров см. В дополнительной таблице 1.

Трансфекция и анализ репортера люциферазы

Фибробласты, выращенные в покрытых фибронектином пластиковых лунках, трансфицировали репортерной конструкцией люциферазы Firefly, управляемой консенсусными мотивами тандемных Smad-связывающих элементов вместе с контрольным вектором люциферазы Renilla, конститутивно управляемым промотером кин-тимерида HSV (Промега, Мэдисон, Висконсин).Трансфицированные фибробласты стимулировали TGF- β (10 нг / мл), и люминесценцию Firefly и Renilla считывали через 24 часа с использованием набора Dual-Glo Luciferase и люминометра (Promega). ²³ Транскрипционная активность Smad рассчитывалась как отношение люминесценции светлячка к люминесценции Renilla.

YAP Silencing

После депривации сыворотки в DMEM и 2% FBS в течение 4 часов фибробласты NRK49F, культивированные в покрытых фибронектином пластиковых лунках, трансфицировали миРНК 10 нмоль / л, направленной против YAP1 или скремблированной миРНК.Через 48 часов после трансфекции подавление YAP было подтверждено с помощью количественной ОТ-ПЦР , и клетки использовали для экспериментов.

Proximity Ligation Assay

Фибробласты NRK49F, выращенные на покрытых фибронектином стеклянных покровных стеклах, обрабатывали вертепорфином (250 нмоль / л) или без него в течение 2 часов, а затем TGF- β (10 нг / мл) в течение 30 минут. Затем клетки подвергали тестам лигирования методом близости Duolink в соответствии с инструкциями производителя (Olink Bioscience, Уппсала, Швеция). ⁵⁰ Вкратце, клетки инкубировали с мышиными первичными антителами против YAP / TAZ человека и кроличьими первичными антителами против Smad2 / 3 человека или с первичными антителами мыши против YAP / TAZ человека и кроличьими антителами против TEAD1. Близость YAP / TAZ к Smad2 / 3 или TEAD1 выявляли путем добавления зондов для анализа на лигирование на основе антимышиных плюсов и кроличьих минус проб с последующим лигированием, амплификацией по методу катящегося круга и гибридизацией с флуоресцентно меченными олигонуклеотидами. Флуоресцентные пятна были визуализированы и количественно определены как интенсивность сигнала анализа ядерной близости лигирования, деленная на ядерный объем.

Животные и хирургия UUO

Исследование 1

Для оценки локализации YAP / TAZ в α -SMA ⁺ почечных фибробластах самцы мышей C57BL / 6 были приобретены в Лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн) и прошли либо левосторонняя UUO или фиктивная операция. Через семь дней после операции мышей умерщвляли, собирали левую почку, фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин и заливали парафином.

Исследование 2 (UUO: раннее лечение вертепорфином)

Чтобы изучить, может ли раннее лечение вертепорфином предотвратить фиброз почек, самцам мышей C57BL / 6 (Лаборатория Джексона) перенесли левостороннюю UUO или фиктивную операцию.Мышей, перенесших операцию UUO, рандомизировали для получения через день внутрибрюшинных инъекций либо вертепорфина (100 мг / кг), растворенного в 10% ДМСО, либо контроля носителя ДМСО в соответствии с ранее опубликованным протоколом. ¹⁹ Лечение началось сразу после операции (день 0) и продолжалось до конца исследования, то есть через 7 дней после операции.

Исследование 3 (UUO: Позднее лечение вертепорфином)

Чтобы изучить, может ли позднее лечение вертепорфином предотвратить прогрессирование установленного фиброза, самцам мышей C57BL / 6 (Лаборатория Джексона) перенесли левостороннее UUO или фиктивную операцию.Мыши, перенесшие операцию UUO, были рандомизированы для получения внутрибрюшинных инъекций либо вертепорфина (100 мг / кг), либо носителя DMSO, как описано для исследования 2. Однако лечение в этом исследовании начиналось на 7-й день после UUO, момент времени, когда наблюдается фиброз почек. уже установлено в закупоренной левой почке, и его продолжали в течение дополнительных 7 дней. Все мыши были умерщвлены через 14 дней после UUO или фиктивной операции.

Сбор тканей, подготовка, гистология и

in situ Гибридизация

В конце исследования у всех мышей собирали левые почки.Замороженные срезы почек окрашивали антителами против Smad2 / 3 и α -SMA. Ткани, фиксированные формалином, заливали парафином и делали срезы перед окрашиванием пикросириусом красным (Sigma-Aldrich) или антителами против α -SMA, YAP / TAZ и коллагена 4 типа. ^51,52 Окрашенные срезы анализировали в цифровом виде с использованием программного обеспечения Aperio Imagescope (Leica Biosystems, Concord, ON, Canada), как описано ранее. ^51–53 Гибридизацию in situ проводили на фиксированных формалином, залитых парафином срезах почек мыши, как описано ранее, ⁵⁴ , и гибридизированный антисмысловой зонд визуализировали с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой антидигоксигенина (Roche, Базель, Швейцария) и субстрат AP пурпурного BM (Roche).

Статистический анализ

Минимум три независимых эксперимента было выполнено для всех исследований in vitro . Представленные данные являются средними значениями ± SEM. Различия между группами измеряли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с анализом наименьшего значимого различия Фишера post hoc , где это необходимо. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism для Mac 6.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Одобрение исследования

Все исследования на животных были одобрены Св.Комитет по этике животных больницы Майкла и соответствовал руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Филипа Марсдена, доктора Лизу Робинсон, доктора Джима Шоли, доктора Крейга Симмонса и доктора Хелен Макнил за полезные обсуждения, а также доктора Эми Вон и доктора Кристофера Йипа за техническую помощь. начальная оптимизация геля.

S.G.S. был поддержан стипендией (магистратура) Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.A.M.S. получил стипендию королевы Елизаветы II в области науки и технологий и стипендию Института знаний Ли Ка Шина. M.F.T. поддерживается стипендией королевы Елизаветы II в области науки и технологий. С.М. поддерживается постдокторской стипендией Канадской диабетической ассоциации. J.L.W. является кафедрой исследований Мэри Джениган в области молекулярной терапии рака. Эта работа была частично поддержана следующими источниками финансирования, присужденными D.A.Y .: грант на инфраструктуру базовой образовательной и национальной программы обучения исследователей почек (KRESCENT), грант Канадского биомедицинского фонда почек KFOC130031, грант J.Грант Фонда П. Бикелла на медицинские исследования, рабочий грант 201503MOP-341962 Канадского института исследований в области здравоохранения и Фонд больницы Святого Михаила. ДЕНЬ. поддерживается премией нового исследователя KRESCENT и ученого-клинициста Канадской ассоциации диабета.

• Copyright © 2016 Американское общество нефрологов.

Наблюдение за первичными ресничками в силикотической ткани легкого. (A) IF-окрашивание …

Контекст 1

… окрашивание показало уменьшение первичных ресничек (отмеченных зеленой флуоресценцией анти-Ac-α-Tub) в силикотических поражениях, сопровождаемое увеличением α-SMA -положительные клетки (рис. 3А).Частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). …

Контекст 2

… окрашивание показало уменьшение первичных ресничек (отмеченное зеленой флуоресценцией анти-Ac-α-Tub) в силикотических поражениях, сопровождаемое увеличением α-SMA-положительных клеток (рис. 3А). Частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F)….

Контекст 3

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F). Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J)….

Контекст 4

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F). Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J)….

Контекст 5

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F). Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J)….

Контекст 6

… результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блот-анализом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (рис. 3E, F). Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J). …

Контекст 7

… окрашивание показало уменьшение первичных ресничек (отмеченное зеленой флуоресценцией анти-Ac-α-Tub) в силикотических поражениях, сопровождаемое увеличением α-SMA-положительных клеток (рис. 3A). Частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). …

Контекст 8

… окрашивание показало уменьшение первичных ресничек (отмеченных зеленой флуоресценцией анти-Ac-α-Tub) в силикотических поражениях, сопровождаемое увеличением α-SMA-положительных клеток (рис. 3А).Частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F). …

Контекст 9

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F).Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J). …

Контекст 10

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F).Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J). …

Контекст 11

… частота и длина первичных ресничек были уменьшены в силикотических узелках по сравнению со стенками альвеол (Рисунок 3B, C). Этот результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блоттингом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (Рисунок 3E , F).Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J). …

Контекст 12

… результат был подтвержден ИГХ окрашиванием Ac-α-Tub (Рисунок S3), определением стоимости γ-тубулина и Ac-α-Tub (Рисунок 3D) и вестерн-блот-анализом Ac-α-Tub и ARL13B у крыс (рис. 3E, F). Мы также обнаружили, что первичные реснички всегда были длинными в перикарциноматозных и перинокулярных тканях легких и терялись в клеточных и фиброзных силикотических узелках с богатым отложением коллагена и окрашиванием IHC α-SMA (Рисунок 3G-J)….

Жестко контролируемая активность MRTF-A регулирует дифференцировку эпителия во время образования ацинусов молочной железы | Исследования рака груди

Активация MRTF во время ацинарного морфогенеза MCF10A

Для исследования процессов, вовлеченных в ацинарный морфогенез, мы культивировали клетки MCF10A молочной железы человека в течение 14 дней в трехмерной органотипической культуре с использованием матригеля в качестве внеклеточного матрикса (ECM) [16]. Мы контролировали образование ацинусов, используя среду с различными концентрациями лошадиной сыворотки.Формирование просвета и поляризация эпителия с заметной локализацией ламинина V на базальной стороне ацинусов легко наблюдались при концентрации 2% в сыворотке (рис. 1а). Напротив, просвет просвета нарушался после культивирования в среде, содержащей повышенный уровень сыворотки. Впоследствии мы измерили промоторную репортерную конструкцию люциферазы, которая зависит от активности модуля фактора транскрипции MRTF / SRF, основного медиатора пути сывороточного ответа. В культурах 2D MCF10A активность MRTF / SRF коррелировала с увеличением концентрации в сыворотке после 7 часов стимуляции (рис.1б).

Рис. 1

Корреляция между активностью миокардин-связанного фактора транскрипции ( MRTF ) -A и ацинарного морфогенеза. Клетки MCF10A выращивали на затвердевшем слое матригеля, покрытом средой, содержащей 2% матригеля и указанное количество лошадиной сыворотки. a Окрашивание фаллоидином ( красный ) и ламинином V ( зеленым ) на 14 день ацинарного морфогенеза клеток MCF10A. Конфокальные изображения репрезентативных сечений средней плоскости. Ядра окрашены синим цветом . b , c MRTF / фактор ответа сыворотки ( SRF ) активность репортера люциферазы. b Клетки MCF10A временно трансфицировали в условиях нехватки сыворотки, обрабатывали через 24 часа, как указано, и анализировали на MRTF / SRF-зависимую промоторную активность через 7 часов. c Кинетика репортерной активности MRTF / SRF во время трехмерного морфогенеза стабильно трансфицированных клеток MCF10A, нормированная на количество белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH ). d Количественная ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК интегрина α5 во время 3D-морфогенеза. Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, ** p <0,01 (тест Стьюдента t ). e MRTF-A и окрашивание ДНК на 4, 5 и 14 дни ацинарного морфогенеза. Масштабная линейка 50 мкм

Чтобы определить, влияет ли транскрипционная активность MRTF-SRF во время ацинарного морфогенеза, мы экстрагировали ацинусы из 3D-культур и измеряли либо индукцию стабильно трансфицированного репортера люциферазы MRTF / SRF, либо экспрессию интегрина α5 гена-мишени MRTF-A.Временной анализ показал сывороточно-зависимые различия в активности MRTF / SRF и кинетике индукции гена-мишени во время образования ацинусов (рис. 1c, d). В условиях 2% сыворотки, пермиссивных для ацинусов, активность репортера MRTF / SRF значительно индуцировалась между 6 и 9 днями, а затем снижалась (рис. 1c). Однако в условиях культивирования, содержащих 5% сыворотки, наблюдалось стойкое увеличение активности MRTF / SRF. В соответствии с репортером, экспрессия мРНК интегрина α5 только временно индуцировалась от трех до четырех раз между 6 и 10 днями ацинарного морфогенеза в 2% сыворотке (рис.1г). При 5% сыворотке измерялась в два-три раза более высокая базальная экспрессия интегрина α5 с последующим небольшим, но устойчивым увеличением до 14 дня (рис. 1d).

Однако изменения транскрипционной активности во время ацинарного морфогенеза не отражались различиями в количестве белка MRTF-A и MRTF-B, которые оставались на постоянно низких уровнях по сравнению с фибробластами (дополнительный файл 1: Рисунок S1) . Таким образом, мы исследовали ядерное накопление MRTF-A, которое часто указывает на усиление передачи сигналов MRTF / SRF.Несмотря на трудности с окрашиванием 3D ацинусов, накопление MRTF-A в ядрах первоначально наблюдалось на 5 день ацинарного морфогенеза и снижалось к 14 дню (Fig. 1e). Эти результаты предполагают, что точный временной баланс MRTF-зависимой экспрессии генов является критическим для ацинарного морфогенеза.

Сверхэкспрессия MRTF-A и MRTF-B вызывает заполнение просвета, дефекты поляризации и увеличенное образование ацинусов трансдукция.Были созданы два независимых пула стабильных клеточных линий MCF10A, демонстрирующих очевидную экспрессию MRTF-B или двукратное увеличение MRTF-A (дополнительный файл 2: рисунок S2A). Эти клеточные линии показали повышенную базальную репортерную активность MRTF / SRF и значительно большую индукцию при добавлении 10% лошадиной сыворотки (дополнительный файл 2: рисунок S2B). Мок-трансдуцированные контрольные клетки MCF10A в анализах ацинарного морфогенеза показали правильно сформированную ацинарную структуру на 14 день с полым просветом, окруженным монослоем эпителиальных клеток (рис.2а, верхняя панель). Как и ожидалось для апико-базальной поляризации, ядра уплощались относительно ламинин V-положительной базальной мембраны, которая плавно окружала всю ацинусы. Кортикальный F-актин локализовался преимущественно в зонах латерального контакта и на апикальной стороне контрольных клеток.

Рис. 2

Заполнение просвета и увеличенный размер ацинусов наблюдались при сверхэкспрессии миокардин-связанного транскрипционного фактора ( MRTF ). Клетки выращивали на матригеле в среде, содержащей 2% матригеля и 2% лошадиной сыворотки, в течение 14 дней, как и раньше. a Иммунофлуоресцентное окрашивание ацинусов, образованных указанными клеточными линиями. Типичные срезы средней плоскости показаны для MRTF-A, MRTF-B, ламинина V ( красный ), фаллоидина ( красный ) и ДНК ( синий ). Масштабная линейка 20 мкм. b Количественная оценка образования просвета, обнаруженная на конфокальных изображениях 30 ацинусов в трех независимых экспериментах. c Размер Acini измерен по изображениям в ярком поле. Показана средняя площадь средней плоскости на клеточную линию по крайней мере для 100 ацинусов в трех независимых экспериментах.Поле представляет межквартильный размах, а средняя линия представляет собой медианное значение; усы распространяются на 5-й и 95-й процентили: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (тест Стьюдента t )

Напротив, сверхэкспрессия MRTF-A или MRTF-B вызывала выраженный фенотип наполнения просвета и увеличение размера после 14 дней культивирования (Рис. 2a, нижние панели).Наблюдалась ложная локализация ламинина V по сфероидам, что свидетельствует о дефектах поляризации. Клетки выпячивались наружу (рис. 2а, отмечены стрелкой) и разрушали равномерно округлую структуру, наблюдаемую в интактных ацинусах. По сравнению с контрольными клетками цитоскелет в некоторых частях оказался нарушенным (рис. 2а, отмечено стрелками). В сфероидах со сверхэкспрессией MRTF-B кортикальный актин также был локализован на базальной стороне. Количественная оценка показала, что наполнение просвета наблюдалось более чем в 85% сфероидов, сверхэкспрессирующих MRTF-A или MRTF-B, по сравнению с менее чем 5% в контрольных ацинусах (рис.2б). Кроме того, линии клеток MRTF-A # 2, MRTF-B # 1 и MRTF-B # 2 образовывали значительно более крупные (в среднем от 1,5 до 2,0 раз) сфероиды, чем контрольные клетки с ложной трансдукцией (фиг. 2c). Вместе эти результаты показывают, что активация MRTF-A или MRTF-B нарушает образование ацинусов и поляризацию эпителия.

Нокдаун MRTF-A нарушает образование ацинусов

Далее мы исследовали функцию MRTF-A во время ацинарного морфогенеза методом потери функции. Нокдаун MRTF-A достигался тремя различными конструкциями экспрессии shRNA (shMRTF-A # 1-3) с использованием двух разных векторных систем по сравнению с клетками, экспрессирующими контрольную shRNA (shCtrl).Кроме того, мы создали клеточные линии, повторно экспрессирующие MRTF-A после нокдауна (sh # 1 + MRTF-A, sh # 2 + MRTF-A). Кроме того, мы создали клеточные линии, сверхэкспрессирующие MRTF-B в клетках с нокдауном MRTF-A (sh # 1 + MRTF-B, sh # 2 + MRTF-B), чтобы изучить функциональную избыточность MRTF-A и MRTF-B.

Клеточные линии с нокдауном MRTF-A сформировали сильно дезорганизованные ацинусы уменьшенного размера без просвета на 14 день (фиг. 3). Полученные структуры состояли из очень небольшого количества клеток, и, следовательно, все клетки имели прямой контакт с ECM.Никаких изменений в локализации поляризационного маркера ламинина V не наблюдалось (рис. 3, дополнительный файл 3: рис. S3A). Повторная экспрессия MRTF-A в клетках shMRTF-A в значительной степени восстанавливала нормальный ацинарный морфогенез, хотя при окрашивании фаллоидином наблюдались некоторые отложения апоптотических клеток. Эти эксперименты демонстрируют, что образование ацинусов, в частности, пролиферация в 3D матригеле, требует MRTF-A.

Рис. 3

Образование ацинусов MCF10A зависит от связанного с миокардином фактора транскрипции ( MRTF ).Стабильно трансдуцированные клетки, несущие контроль или нокдаун MRTF-A ( shCtrl , shMRTF-A # 1 , shMRTF-A # 2 ), получают MRTF-A ( sh # 1 + MRTF-A , sh # 2 + MRTF-A ), спасение с MRTF-B ( sh # 1 + MRTF-B , sh # 2 + MRTFB ) или контрольное спасение ( shCtrl + GFP ) культивировали в матригеле в течение 14 дней. как прежде. Показано иммунофлуоресцентное окрашивание MRTF-A, MRTF-B, ламинина V ( красный ), фаллоидин ( красный ) и ДНК ( синий ) из репрезентативных срезов конфокальной средней плоскости. Шкала шкалы 20 мкм

Интересно, что экспрессия MRTF-B в клетках с нокдауном MRTF-A не способна полностью восстановить собственно ацинарный морфогенез (Рис. 3, нижние панели). LamininV располагался на базальной стороне, но ацинусы были больше. Более того, в клетках, которые контактируют с ЕСМ, кортикальный F-актин не ограничивается боковыми сторонами. В просвете обнаружены нарушенные фаллоидин-положительные структуры мертвых и живых клеток (рис. 3).

Количественная оценка проиллюстрировала изменения размера ацинусов, наблюдаемые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (рис.4а). Размер структур нокдауна MRTF-A был уменьшен от двух до трех раз, в то время как повторная экспрессия MRTF-A в клетках shMRTF-A по существу восстановила размер ацинусов. Напротив, экспрессия MRTF-B в клетках с нокдауном MRTF-A увеличивала ацинусы до размера, большего, чем у контролей. Количественная оценка образования просвета показала, что более 90% ацинусов с нокдауном MRTF-A не содержат просвета, что, вероятно, вызвано уменьшением размера ацинусов (рис. 4b, дополнительный файл 3: рис. S3B). Повторная экспрессия MRTF-A в клетках с нокдауном MRTF-A спасала этот эффект, в то время как экспрессия MRTF-B в ацинусах с нокдауном MRTF-A имела просвет, частично заполненный живыми клетками и клеточными остатками примерно в 80% ацинусов (рис.4б). Это указывает на частично неизбыточную функцию MRTF-A и MRTF-B во время ацинарного морфогенеза.

Рис. 4

Количественная оценка размера ацинусов, наполнения просвета и активности миокардин-связанного фактора транскрипции ( MRTF ). a Количественная оценка размера ацинусов на изображениях в светлом поле. Размер по крайней мере 100 ацинусов измеряли в каждом из трех независимых экспериментов, как описано. Поле представляет межквартильный размах, а средняя линия представляет собой медианное значение; усы простираются на 5-й и 95-й процентили. b Количественная оценка образования просвета, обнаруженная на конфокальных изображениях 30 ацинусов в каждом из трех различных экспериментов. c Относительная экспрессия белков MRTF-A и MRTF-B в указанных линиях клеток с нокдауном и восстановлением. Показано среднее значение трех независимых экспериментов. Репрезентативный иммуноблот MRTF-A и MRTF-B из 2D клеточных культур показан ниже. d Указанные клеточные линии временно трансфицировали в условиях недостатка сыворотки, обрабатывали через 24 часа, как указано, и анализировали на активность MRTF / сывороточного фактора ответа. Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, *** p <0,001 (тест Стьюдента t ). shCrtl контроль shRNA, GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, GFP зеленый флуоресцентный белок

Молекулярная характеристика показала, что экспрессия MRTF-A была снижена до 20% в нокдаун-клетках по сравнению с контрольными клетками (фиг. 4c). Это сопровождалось снижением индуцибельности репортера MRTF / SRF до уровня, сопоставимого с сывороточной активностью контрольных клеток (рис.4d, Дополнительный файл 3: Рисунок S3). В спасательных клетках MRTF-A экспрессия MRTF-A и репортерная активность по существу восстанавливались до уровня клеток shCtrl. В клетках с нокдауном MRTF-B, сверхэкспрессирующими MRTF-A, наблюдали полностью восстановленную MRTF / SRF-зависимую активность промотора после стимуляции сывороткой.

MRTF влияют на регуляторы клеточного цикла

Чтобы исследовать причины наблюдаемых изменений в ацинусах MRTF нокдауна, мы проанализировали регуляторы пролиферации и клеточного цикла. Мы окрашивали 3D-культуры маркером пролиферации Ki67 на 4-й день, чтобы визуализировать пролиферирующие клетки на ранних стадиях ацинарного морфогенеза.Кроме того, мы проанализировали ингибиторы циклин-зависимых киназ (CKI) p21 / Waf1, p27 / Kip1 и количество общего и фосфорилированного белка ретинобластомы (Rb) с помощью иммуноблоттинга ацинусов, выделенных на 14-й день.

На 4-й день мы почти не обнаружили. любые Ki67-положительные клетки в любом из трех ацинусов с нокдауном MRTF-A в отличие от контрольных ацинусов (фиг. 5a, дополнительный файл 3: фиг. S3E). Вместо этого была видна повышенная экспрессия p21 / Waf и p27 / Kip, в то время как Rb был гипофосфорилирован (фиг. 5b, c).В MRTF-A rescue acini Ki67 экспрессировался до аналогичного уровня по сравнению с контролем (дополнительный файл 4: рисунок S4). Это предполагает, что нокдаун MRTF-A нарушает пролиферацию за счет активации CKI и предотвращения фосфорилирования Rb (S780). Интересно, что экспрессия MRTF-B в клетках с нокдауном MRTF-A приводила к увеличению Ki67-позитивных клеток по сравнению с уровнем родительских или ложно-трансдуцированных контрольных ацинусов (фиг. 5a). Точно так же экспрессия p21 / Waf и p27 / Kip была снижена до почти неопределяемых уровней (рис.5б, в). Это говорит о том, что увеличенный размер ацинусов с нокдауном MRTF-A частично восстанавливается MRTF-B и может быть результатом повышенной клеточной пролиферации на основе снижения экспрессии CKI.

Рис. 5

Нокдаун связанного с миокардином фактора транскрипции ( MRTF ) -A нарушает пролиферацию и клеточный цикл. Линии клеток a Knockdown и recue культивировали в матригеле в течение 4 дней и окрашивали на маркер пролиферации (шкала 20 мкм). Количественное определение Ki67-положительных клеток на ацинусы, определенное из 30 ацинусов в трех различных экспериментах. b , c Белки из ацинусов, выделенные на 14 день, были подвергнуты иммуноблоттингу на p21 и p27 ( b ) или белок фосфо-ретинобластомы ( P-Rb ) и белок ретинобластомы ( Rb ) ( c ) . Верхние панели показывают нормализованное содержание белка, а репрезентативный иммуноблот показан ниже. Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, ** p <0,01 (тест Стьюдента t ). SRF фактор ответа сыворотки. shCrtl контроль shRNA, GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, GFP зеленый флуоресцентный белок

Таким образом, мы повторно рассмотрели клетки со сверхэкспрессией MRTF-A или MRTF-B, чтобы проанализировать регуляторы пролиферации, апоптоза и клеточного цикла в их ацинусах, заполненных просветом. Поразительно, что сверхэкспрессия MRTF-A и MRTF-B вызывала примерно 90% -ное снижение белка p27 / Kip и 75% -ное снижение белка p21 / Waf во время ацинарного морфогенеза (рис.6а). За исключением линии MRTF-A # 1, все сфероиды показали значительно более высокое фосфорилирование Rb (S780), хотя общий Rb был снижен в сфероидах, сверхэкспрессирующих MRTF-B (фиг. 6b). Эти результаты предполагают, что увеличенный размер заполненных сфероидов со сверхэкспрессией MRTF обусловлен нарушением регуляции контрольных точек клеточного цикла.

Рис. 6

Сверхэкспрессия миокардин-родственного транскрипционного фактора ( MRTF ) влияет на регуляторы клеточного цикла. a , b p21, p27, белок фосфо-ретинобластомы ( P-Rb ) и белок ретинобластомы ( Rb ) экспрессия на 14 день ацинарного морфогенеза указанных линий клеток с избыточной экспрессией MRTF.Ниже показаны нормализованное содержание белка и типичный иммуноблот. Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, ** p <0,01 (тест Стьюдента t ). GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

Далее, мы исследовали апоптоз внутренних клеток на 6-й день образования ацинусов, используя расщепленную каспазу 3 в качестве маркера апоптоза. В то время как контрольные клетки ясно показали окрашивание внутренних клеток расщепленной каспазой 3, расщепленная каспаза 3 не была обнаружена в сфероидах, сверхэкспрессирующих MRTF-A или MRTF-B (рис.7а). Чтобы определить, можем ли мы усилить формирование просвета и апоптоз в сфероидах с избыточной экспрессией MRTF, мы экспериментально увеличили жесткость матрицы путем добавления коллагена. В то время как постоянно затвердевшие гели нарушали образование ацинусов (данные не показаны), временное добавление 10% коллагена в день 5.5 в течение 2 дополнительных дней действительно ускоряло образование просвета в контрольных ацинусах, при этом ламинин V правильно расположен на базальной стороне (фиг. 7a, а данные не указаны). показано). Интересно, что в обработанных коллагеном сфероидах со сверхэкспрессией MRTF-A просвет все еще не сформировался, в то время как 70% обработанных коллагеном контрольных ацинусов продемонстрировали полное формирование просвета в этих условиях (рис.7а, б). Это указывает на то, что сверхэкспрессия MRTF-A эффективно предотвращает апоптоз или аноикис клеток, которые не контактируют с базальной пластинкой.

Рис. 7

Влияние связанного с миокардином фактора транскрипции ( MRTF ) во время апоптоза просвета при нормальном и ускоренном образовании ацинусов. a Клетки выращивали в матригеле с 10% коллагена в течение последних 2 дней, если указано. Показано окрашивание репрезентативных срезов средней плоскости фаллоидином ( красный ), расщепленной каспазой 3 ( зеленый ), Ki67 ( красный ) и ДНК ( синий ).Количественное определение Ki67-положительных клеток на ацинусы; Было проанализировано по 30 ацинусов каждая. Масштабная линейка 20 мкм. b Количественная оценка образования просвета ложно-трансфицированных контрольных ацинусов на 8-й день. Анализ 30 ацинусов каждой, с или без предварительной обработки коллагеном. c Динамика активности репортера люциферазы фактора ответа MRTF / сывороточного фактора ( SRF ) во время трехмерного морфогенеза стабильно трансфицированных репортерных клеток MCF10A, нормализованная по содержанию белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH ). Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 (тест Стьюдента t )

Сходным образом, сфероиды, сверхэкспрессирующие MRTF-B, лишены образования просвета в принудительных условиях, хотя наблюдаются некоторые расщепленные каспаза-3-положительные клетки. Однако локализация расщепленной каспазы 3 не ограничивалась внутренними клетками, как видно в контроле (рис. 7a). На 14 день нормального морфогенеза более 80% сфероидов со сверхэкспрессией MRTF-A или MRTF-B обладали расщепленной каспазой 3 и определяемыми Ki67-положительными клетками, распределенными по сфероидам (рис.7a, Дополнительный файл 5: Рисунок S5). Взятые вместе, это показывает, что как аберрантная пролиферация, так и апоптоз происходят одновременно в сфероидах с избыточной экспрессией MRTF, что в конечном итоге приводит к заполнению просвета отложениями апоптотических клеток.

Участие активности MRTF в ускорении просвета просвета обработкой коллагеном анализировали во время морфогенеза стабильно трансфицированных репортерных клеток MRTF / SRF. Двухдневная обработка коллагеном заметно усиливала индукцию репортерной активности MRTF / SRF-люциферазы по сравнению с нормальными условиями культивирования ацинусов на 6-7 дни (рис.7в). До дня 9 активность MRTF / SRF с усилением коллагена вернулась к базальному уровню, обнаруженному в дни 1-3. Как и раньше, эти результаты согласуются с важной ролью индукции и / или остановки MRTF во время образования ацинусов и указывают на то, что эндогенные MRTF передают механические сигналы от ECM.

Постоянная сверхэкспрессия / активность MRTF вызывает ЕМП в клетках MCF10A

Исследования иммунофлуоресценции показывают, что выживаемость клеток приобретает независимость от контакта с ЕСМ при сверхэкспрессии MRTF в сфероидах.Следовательно, мы исследовали рост, не зависящий от закрепления. Клетки MCF10A не могли расти независимо от закрепления и не образовывали колоний в мягком агаре, в соответствии с предыдущими сообщениями [26]. Напротив, клетки с избыточной экспрессией MRTF выживали и образовывали небольшие колонии через 6 недель культивирования в мягком агаре, демонстрируя их приобретенную способность к независимому от закрепления росту (фиг. 8a). Мы определили экспрессию и локализацию интегрина α5 и интегрина α6, чтобы исследовать, вызывает ли переключение интегрина наблюдаемое поведение роста.Интегрин α5 рецептора фибронектина является известным геном-мишенью MRTF-A, тогда как интегрин α6 является эпителиальным маркером, участвующим в связывании ламинина. Поразительно, что локализация интегрина α6 на внешней стороне ацинусов была потеряна в обоих сфероидах, сверхэкспрессирующих MRTF-A или MRTF-B (фиг. 8b). Напротив, интегрин α5 преимущественно локализовался на базальной стороне сфероидов, сверхэкспрессирующих MRTF, тогда как контрольные ацинусы демонстрировали только диффузное и слабое окрашивание интегрина α5. Более того, иммуноблоттинг показал, что экспрессия интегрина α5 индуцировалась двукратно в ацинусах с увеличением функции MRTF (рис.8c).

Рис. 8

Независимый от якорения рост и экспрессия маркера эпителиально-мезенхимального перехода, регулируемая миокардин-связанным фактором транскрипции ( MRTF ). — Клетки со сверхэкспрессией MRTF выращивали в агарозном матриксе. Микрофотографии в светлом поле были сделаны через 6 недель. Масштабная линейка 400 мкм. b Окрашивание интегрином α5 и α6 14-дневных ацинусов, образованных указанными клеточными линиями. Масштабная линейка 20 мкм. c Экспрессия белка интегрина α5, E-кадгерина, виментина и Snai2 / Slug в 2D-культурах линий клеток, сверхэкспрессирующих MRTF.Показаны репрезентативный иммуноблот ( слева, ) и количественная оценка нормализованного количества белка ( справа, ). Планки погрешностей SEM (n = 3): * p <0,05, ** p <0,01 (тест Стьюдента t ). GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

Наблюдаемое переключение интегрина и независимость от закрепления указывают на измененную клеточную адгезию и / или переход от эпителиальной к инвазивной судьбе мезенхимальных клеток.Таким образом, мы исследовали экспрессию дополнительных эпителиальных и мезенхимальных маркеров в ацинусах / сфероидах, сверхэкспрессирующих MRTF-A или MRTF-B. Мы обнаружили заметное снижение уровня белка эпителиальных адгезивных соединений E-cadherin (рис. 8c). Одновременно мезенхимальные маркерные белки vimentin и Snai2 индуцировались приблизительно в два раза и в шесть-десять раз в клетках со сверхэкспрессией MRTF, соответственно. В то время как мРНК Twist оставалась неизменной, экспрессия мРНК Zeb1 увеличивалась от двух до трех раз (дополнительный файл 6: рисунок S6).В совокупности эти результаты предполагают участие функции MRTF в дедифференцировке эпителиальной архитектуры молочных желез и подтверждают важную регуляторную роль MRTFs во время образования ацинусов.

Повышенная экспрессия MRTF-A и генов-мишеней коррелирует со снижением выживаемости при раке груди

Наконец, мы исследовали, актуален ли MRTF-A при раке груди человека. Используя платформу визуализации R2, два разных набора данных по раку груди были проанализированы на предмет связи между экспрессией целевого гена MRTF-A или MRTF-A и выживаемостью пациентов.В когортах из наборов данных Clynes [24] и Bertucci [25] высокое содержание мРНК MRTF-A было значительно связано с более низкой 8-летней выживаемостью среди пациентов (рис. 9a). Скорректированный по возрасту HR составил 2,42 (95% ДИ 1,13–5,15) у 104 пациентов со смешанными типами рака груди [24]. В наборе данных Bertucci медуллярного рака молочной железы подтипа A и B просвета, скорректированный по возрасту HR составил 2,32 (95% ДИ 1,01–5,34) [25]. Таким образом, у пациентов с высокой экспрессией MRTF-A риск смерти от рака увеличивался более чем в два раза по сравнению с пациентами с низкой экспрессией MRTF-A (рис.9а).

Рис. 9

Показатели выживаемости у больных раком груди с высокой экспрессией связанного с миокардином фактора транскрипции ( MRTF ) -A и его генов-мишеней. Наборы данных экспрессии мРНК микрочипов Clynes [24] и Bertucci [25] были проанализированы с использованием микрочипа R2 и программного обеспечения платформы визуализации. a графики Каплана-Мейера для 96 месяцев наблюдения за 104 пациентами со смешанными типами рака груди (Clynes) или люминальной A / B подгруппой пациентов с медуллярным раком груди (n = 129; Bertucci), используя p Метод сканирования значений .Относительные отношения рисков (HR) для высокой экспрессии MRTF-A ( синие линии ) были рассчитаны после поправки на возраст и регрессионного анализа Кокса. Прочерки обозначают пациентов, подвергшихся цензуре. b Вероятность пятилетнего выживания у пациентов с низкой или высокой экспрессией генов-мишеней MRTF ACTA2 , TAGLN , ITGA5 и CTGF . Данные были извлечены из графиков Каплана-Мейера указанных наборов данных: p значений были рассчитаны для значимых различий с использованием критерия логарифмического ранга

Поскольку экспрессия MRTF-A не обязательно отражает его транскрипционную активность, известные гены-мишени MRTF-A ACTA2 , TAGLN , ITGA5 и CTGF также были проанализированы в этих наборах данных.Пятилетняя выживаемость в целом была ниже среди пациентов с высокой экспрессией ACTA2 , TAGLN , ITGA5 и CTGF (рис. 9b).