Техника окрашивания air tach: техника выполнения и фото с идеями

Трендовые окрашивания. Мини-словарик. | MIRA

22.06.2019Комментарии к этой записи отключены.

Airtouch, Handtouch, Балаяж и много еще красивых трендовых слов, Вы часто слышите в салонах или видите в глянцевых журналах. Но что же это такое и как найти именно то окрашивание, которое будет для Вас комфортным!

Мы подготовили мини словарик,  часто встречающихся модных слов.

Airtouch– «Прикосновение воздуха», в основе окрашивания лежит усовершенствованное мелирование.  Волосы перед нанесением  обесцвечивающего порошка разделяют на пряди, а затем обдувают струей воздуха из фена, так что осталось 30-50% первоначально объема. Каждую прядь тчательно окрашивают с растушевкой границ сухой кистью для придания эффекта бликов, а потом заворачивают в фольгу или прозрачную пленку.

Airtouch, одна из наиболее сложных и длительных техник окрашивания, время работы занимает от 5 и до 7 часов. Но эффект Вас очень порадует и результатом и длительностью. Так как отросшие корни выглядят очень естественно, а качество волос минимально травмируется!

Цена от 3200-5000 гривен

Балаяж– с французкого переводится как «смахивать». Техника Балаяж заключается в создании эффекта выгоревших на солнце волос, методом нанесения порошка и красителей только кончиком кисти и только по верхнему слою. Мазки наносятся горизонтально к пряди.

Одно из наиболее распространенных уже на протяжении нескольких лет окрашиваний.

Цена от 1500-2400 гривен

Nude– если вы стремитесь к ощущению спокойствия с легкими  элементами бликов, то это именно Ваша техника.

Натуральное окрашивание, в котором отсутствует контрастность, а осветленные пряди смогут отличаться друг от друга всего на 1-1,5 тона.

В основу для окрашивания Nudeвыбирают очень теплые, солнечные оттенки, натуральный русый, медовый, теплые каштановые оттенки и тд.

Цена от 1500 до 2400 гривен

HandTouch– техника очень похожа на airtouch, но есть значительные отличия:

– нанесения порошка и красителя рукой

– Более широкие пряди

– Более темный общий тон, из-за меньшей доступности к корням

– и самое главное отличие, это время, окрашивание занимает около 4 часов.

Цена от 3200 до 3900 гривен

Омбре–  с французкого переводится как «затемнение», в чем и заключается вся суть окрашивания. С помощью красителей создается плавный градиент по всей длине от темного к светлому.

Омбре смотрится очень стильно, как в светлых оттенках, так и в темных.

Цена от 1500-2400 гривен

Окрашивание волос техникой Airtouch: особенности и преимущества процедуры

01 / 07 / 20

Окрашивание волос техникой Airtouch: особенности и преимущества процедуры

Новинки окрашивания волос, которые являются последними разработками стилистов, полюбились многим девушкам. На сегодняшний день наиболее востребованной является техника окрашивания волос, которая имеет название «Airtouch» или «Эир Тач». Название данной методики состоит из двух слов: touch и air. Переводится это сочетание слов как «прикосновение воздуха».

Окрашивание Airtouch – это уникальная техника, которая придает волосам многогранность оттенков одного цвета. Основное отличие данной процедуры от других способов окрашивания – в отсутствии травм волос, щадящем изменении цвета и достижении естественных оттенков.

Airtouch – подход к окрашиванию, который рекомендуется доверить мастерам нашей студии, поскольку каждый из них владеет данной техникой окрашивания, а также постоянно повышает квалификацию. Специалисты, которые обладают достаточным объемом знаний и навыками в данной области, предоставляют каждой клиентке лучший результат работы.

Что такое Airtouch? Какие отличия данного подхода от других способов мелирования?

Airtouch – техника окрашивания, которая отличается от других подходов к мелированию целым рядом характеристик:

• Пряди для окрашивания выбираются при помощи создаваемых потоков воздуха.
• Существует возможность сочетать любую длину волос с данной техникой окрашивания (Airtouch является универсальной техникой и подходит для всех форм причесок и типов волос).
• Airtouch – техника, в которой отсутствуют резкие и заметные переходы от одного оттенка к другому, что делает вид волос более естественным.
• Безопасность техники мелирования Airtouch (пигменты, которые мастера используют в данном подходе, не содержат опасных для волос и организма человека примесей, таких как аммиак).
• Сохранение эффекта окрашивания в течение длительного периода времени (в отличие от применения других техник по изменению цвета волос).
• Эффектный результат мелирования (благодаря профессиональному отделению прядей, которые нуждаются в окраске, а также прядей, не нуждающихся в новом оттенке).

Особенности мелирования Airtouch: преимущества техники окрашивания волос

Мелирование волос с помощью техники Airtouch отличается целым рядом преимуществ по сравнению с другими подходами к окрашиванию волос:

• Airtouch – техника, которая может применяться для женщин всех возрастных групп. Не существует ограничений для применения данного способа мелирования.
• В результате окрашивания возникает эффект объемной прически. Мастер достигает такого результата за счет качественного окрашивания с эффектом глубины оттенков.
• Окрашивание волос с применением данной техники отличается высокими показателями безопасности, поскольку работа выполняется с отдельными локонами.
• После мелирования с помощью Airtouch не существует ограничений, касающихся смены прически и кардинальной смены имиджа.
• При необходимости с помощью окрашивания Airtouch существует возможность визуального омоложения внешнего вида и образа женщины.
• Существует возможность подобрать и применить несколько цветов и оттенков для создания эффектного образа.

Отличия и нюансы Airtouch для разных оттенков волос

Популярность данного способа окрашивания заключается в возможности достичь натурального и в то же время глубокого, привлекательного цвета волос. Такой цели удается достичь благодаря применению плавного перехода от одного оттенка к другому. Однако правила подбора оттенков для окрашивания русых и темных волос имеют значительные отличия.

Обладательницам светлых волос следует обратить внимание на медные и медовые оттенки. Наиболее привлекательное окрашивание Airtouch на темные волосы – с применением карамельных оттенков, цвета кофе с молоком, а также светло-ореховых оттенков. Окрашивание Airtouch на русые волосы для достижения естественного вида волос – с выбором в пользу оттенков, на несколько тонов светлее натурального цвета локонов.

Этапы мелирования Airtouch: как выполняется окрашивание?

Тонирование техникой Airtouch выполняется в соответствии с определенными этапами, что позволяет достичь желаемого, наиболее привлекательного результата окрашивания. Мастера нашего салона красоты Bloom владеют данной техникой мелирования, а также постоянно совершенствуют свои навыки.

Процедура мелирования имеет следующие этапы:

• Этап подготовки, на котором подбираются тона для мелирования. Для достижения максимально естественного результата и здорового блеска мастер оценивает имеющийся оттенок волос и особенности локонов. Также на подготовительном этапе определяется временной период, необходимый для достижения требуемого результата.
• Этап подготовки инструментов, необходимых для выполнения мелирования. Мастер подготавливает пигмент, фен, кисти для нанесения состава, фольгу.
• Выполняется тщательное расчесывание волос (качество данного этапа во многом определяет получаемый результат).
• Тщательное разделение волос на отдельные пряди. Толщина каждой пряди – не более одного сантиметра.
• Выполняется работа с прядями волос при помощи фена. Мастер удерживает каждую прядь волос, направляя на нее поток воздуха. В результате получают наиболее толстые волосы, которые отделены от тонких и коротких волос. С полученными прядями мастер продолжает работу.
• Под полученные пряди подкладывается заранее подготовленная фольга.
• Выполняется окрашивание прядей при помощи кисти. Мастер окрашивает прядь от корней, сделав отступ от 3 до 5 сантиметров.
• Мастер контролирует время воздействие пигмента на окрашиваемые пряди.
• По истечении необходимого времени фольга удаляется, а краска смывается.
• После окрашивания мастер наносит на волосы кондиционер.

Учитывая вышеперечисленные этапы, проводить мелирование в домашних условиях с помощью данной технологии не рекомендуется. Следует доверить окрашивание опытному мастеру.

Сколько держится эффект после окрашивания Airtouch и какой уход необходим волосам?

Популярная технология окрашивания волос отличается продолжительным результатом, который имеет эффектный вид от 6 месяцев до одного года. Однако при необходимости повторять процедуру можно каждый месяц. Для того, чтобы максимально продлить полученный от мелирования эффект, рекомендуется придерживаться несложных правил.

Прежде всего, не следует самостоятельно подбирать средства, которые могут обесцвечивать имеющийся оттенок. К примеру, не рекомендуется пользоваться кокосовым маслом после выполнения окрашивания. Для того чтобы устранить эффект пушистых волос, мастера рекомендуют применять питательные маски и крема. Кроме того, необходимо уделять внимание питанию кончиков волос. Также не желательно использовать жесткую воду для мытья головы.

В зимний период необходимо защитить волосы от ветра и мороза. Летом следует использовать специальные средства, которые защищают локоны от ультрафиолета. Выполняя все советы по уходу за волосами, существует возможность сохранить результат окрашивания на длительный период.

Хитовая техника окрашивания — Airtouch

Уже несколько сезонов на пике популярности техники мультитонального окрашивания. Сейчас мало кому интересен плоский моноцвет на волосах. Омбре, сомбре, блочное окрашивание, балаяж, шатуш – виды покраски, с помощью которых можно добиться интересных объемных эффектов на волосах. Казалось бы, ввиду такого многообразия техник сложно придумать что-то новое. Но колористы не любят почивать на лаврах и останавливаться на достигнутом, ведь клиенты всегда требуют чего-то нового, не такого, как у всех, что выделит их из толпы. Так появилась кардинально новая техника airtouch.

Работа Салона красоты Naturel Studio

Что такое Airtouch

Airtouch представляет собой сложное многоцветное окрашивание с мягкими переливами нескольких родственных оттенков. Большим преимуществом новой техники является плавный рассеянный переход осветленных и неосветленных прядей. За счет этого граница отрастания натуральных корней растушевана так мягко, что даже спустя несколько месяцев окрашивание выглядит очень красиво, словно выполнено накануне.

Окрашивание волос airtouch – технологически сложный и кропотливый процесс. Работа с длинными густыми волосами может занять 3-6 часов. На сегодняшний день существует несколько схем осветления прядей методом airtouch, каждая из которых подбирается под форму стрижки.

Работа Стилиста-парикмахера Марины Фоменко

Иногда в описании техники можно встретить словосочетание «мелирование airtouch», но это не совсем корректно. Действительно, как и в классическом мелировании, часть прядей осветляется, а часть остается нетронутой или затемняется. Но то, каким способом это делается и какой результат получается на выходе, позволяет говорить, что airtouch – окрашивание нового поколения.

Работа Лаборатории колористики R.G.B.

Техника окрашивания

В определенной последовательности по всей голове выделяются тонкие слайсы волос. Каждую прядь держат в оттяжке к поверхности головы 90 градусов, направляя поток холодного воздуха от фена сквозь прядь. При этом часть волос «выдувается», а часть остается в руках. На волосы, которые остались зажатыми между пальцами, наносят осветляющий состав и заворачивают в фольгу. Таким образом прорабатывают всю массу волос.

Работа Лаборатории колористики R. G.B.

Осветлять пряди можно, отступая на несколько сантиметров или впритык к корню. Все зависит от того, какой эффект хотите получить. В первом случае готовое окрашивание будет похоже на градиентное. Второй способ позволяет добиться максимально светлого результата. Окрашивание волос airtouch можно делать с затемнением корней или оставлять их неокрашенными. Осветленные пряди обязательно тонируют, чтобы нейтрализовать нежелательные оттенки.

Окрашивание волос Airtouch в салоне красоты в Москве: цены, фото, отзывы

Техника окрашивания волос Airtouch состоит из определенных схем. В нашем салоне применяются несколько таких схем. Каждая отобранная прядь обдувается феном. Воздух должен быть холодным, чтобы не нанести вред локонам. Таким образом, тонкие и короткие волоски освобождают основную массу волос. Тщательно отобранные прядки будут в дальнейшем прокрашиваться. Благодаря такому кропотливому разделению прядей, волосы приобретают красивые, многогранные переходы. Именно благодаря воздействию фена, техника получила название Airtouch — прикосновение воздуха.

Окрашивание волос Airtouch в салоне Hair Lab проводится при помощи высококачественных красок и осветляющего состава. Перед тем, как приступить к работе, наши колористы обращают внимание на состояние волос, а также на цветотип клиента. Тон может быть выбран любой — теплый или холодный. Наши стилисты помогут вам подобрать именно тот оттенок, который подойдет именно вам. Во время окрашивания мастер тщательно контролирует процесс осветления прядей, чтобы максимально сохранить их мягкими и здоровыми. Эффект сохраняется от 6 до 12 месяцев. Вам нужно будет всего-навсего изредка тонировать корни, чтобы сохранить плавный переход.

Окрашивание волос Airtouch в Москве осуществляется по следующей технике:

• Перед началом процедуры волосы тщательно расчесываются.
• Как уже было сказано выше, пряди отбираются по определённой схеме разделения. Каждая прядка обрабатывается с помощью фена. Холодный воздух освобождает основную массу от тоненьких и коротких волосков.
• Пряди приподнимаются от поверхности головы под прямым углом. Чем тоньше они, тем эффектнее будет результат.
• Далее разделенные пряди обрабатываются красителем и аккуратно заворачиваются в фольгу. Также можно использовать термобумагу или хлопковый валик.
• Краска должна наносится на расстоянии от 3 до 5 сантиметров от корней.
• Время обесцвечивания подбирается индивидуально. Необходимо наблюдать за процессом визуально. Колорист контролирует процесс обесцвечивания волос и следит за тем, чтобы краска не нанесла вред локонам.
• После того, как пряди приобрели желаемый оттенок, краска смывается, волосы обрабатываются смягчающим кондиционером, делается укладка.

Главным преимуществом данной техники является то, что непревзойденный эффект не зависит от длины и густоты прядей. Такое тонирование подойдет обладательницам всех типов волос. Цена на окрашивание волос Airtouch в салоне красоты Hair Lab является довольно приемлемой. Позволить себе сделать такое тонирование может позволить себе каждая женщина.
Чтобы лучше понять, что представляет собой данный метод, предлагаем посмотреть фото окрашивания волос Airtouch на нашем сайте.

шатуш, амбре, балеяж, брондирование, airtouch

Каждый год появляются новые техники и веяния – балаяж, брондирование, стеклянный эффект, калифорнийское, венецианское мелирование и airtouch, скандинавский пойнт, омбре, шатуш и другие. Правильный выбор техники и соблюдение технологии сделает окрашивание долговечным без ущерба волосам. Самые популярные тренды можно воплотить у нас, главное определиться, что вы хотите.

Каждый год появляются новые техники и веяния – балаяж, брондирование, стеклянный эффект, калифорнийское, венецианское мелирование и airtouch, скандинавский пойнт, омбре, шатуш и другие. Правильный выбор техники и соблюдение технологии сделает окрашивание долговечным без ущерба волосам. Самые популярные тренды можно воплотить у нас, главное определиться, что вы хотите.

Мелирование – новые решения в классическом методе

Такой способ окрашивания давно уже у всех на слуху, при этом современный вариант выглядит свежо и нетривиально. Красавицы с красных дорожек кинофестивалей тому яркое подтверждение.

Наиболее популярным сейчас является калифорнийское и венецианское мелирование, в зависимости от натурального цвета, и airtouch, когда для окрашивания используется не только краска, но и брашинг. Любители запоминающихся и провокационных образов выбирают графическое и цветное окрашивание контрастными, в том числе зелеными, синими, красными, фиолетовыми красками.

Калифорнийское мелирование выглядит естественно на обладательницах всех оттенков русых и светлых волос, оно создает сияющий эффект выгорания по солнцем, с натуральным цветом корней и более светлыми кончиками. Лучше всего подходит для желающих изменить свой образ, чтобы создать эффект омоложения и густоты.

Это самое практичное мелирование, переживать за отросшие корни долго не придется. Если окрашивание выполняет профессионал, то в работе используются до 5 цветов красок, близких по тону, которые создают эффект мерцания, придают объем и натуральный вид.

Калифорнийское мелирование идеально смотрится на прическах из длинных и средней длины волос, на коротких его обычно не делают, смотрится нелепо.

Венецианское мелирование подходит наоборот, брюнеткам, когда подбираются оттенки светлее или несколько темнее своего цвета и, создавая переливы и игру янтарных, медовых, карамельных, древесных оттенков. Для огненных девушек используются оттенки медь, бордо, карамель, рубиновые и другие, которые дают эффект извержения вулкана и позволяют любоваться спадающей с плеч лавой или изящно обтекающей головку прической.

Airtouch самый сложный и требовательный к мастеру вид окрашивания. Чтобы добиться впечатляющего эффекта, мастер должен иметь определенный опыт владения брашингом и кистью, иметь хорошие познания в колористике. Airtouch – это самое щадящее мелирование, оно позволяет окрасить только сильные волосы, давая возможность слабым и тонким остаться в естественном цвете.

При таком окрашивании мастер берет прядку и выдувает брашингом из нее примерно половину волос. Окрашивание идет только тех, что остались после обдува. Это позволяет изменить цвет только очень тоненьким прядкам, добиться переливчатости при максимальном сохранении естественности. Или наоборот, создать совершенно новый образ, применив краску из другой цветовой гаммы. Краска может наноситься на минимальном расстоянии от корней или отступив несколько сантиметров.

Брондирование — многоцветность коричневого

Современное мелирование давно вышло за рамки банального осветления и дало старт множеству эффектных техник, позволяющих добиться уникального окраса, сохраняя при этом естественный вид прически. Брондирование относится к их числу. Фактически это окраска прядей более темными, чем естественный цвет красками, преимущественно коричневых и бронзовых оттенков.

При этом создается эффект рельефности, пышности, естественности. Брондирование используют как на длинных, так и на коротких волосах – эффект есть всегда!

Шатуш – рисование по волосам

Основное отличие этой техники, что эффект выгоревших волос создается размыто, без четкого перехода от темного к светлому. Основное отличие этой техники – начесывание каждой прядки и окраска в таком виде. За счет этого создается эффект размытости и естественности. Добиться такого эффекта можно на волосах любого оттенка.

Супер-профессионал может использовать шатуш и без начеса, но это занимает больше времени и является очень кропотливой и творческой работой. Волосы разделяются на очень тонкие прядки и новый цвет буквально прорисовывается.

Балаяж – многоцветье оттенков

Окраска с использованием нескольких оттенков, главное требование по качеству – отсутствие скачкообразных переходов и разрывов в краске. Подходит обладательницам любого цвета, окрашиваются только кончики или пряди у лица, придавая прическе визуально объем. Техника очень щадящая, подходит для тонких и ослабленных волос.

Омбре – ультимативный контраст

Если нет желания добиваться естественности прически, а хочется выделиться и стать заметной, то двухцветное окрашивание или тонирование длинных волос в стиле «омбре» именно для вас! Окрашивание выполняется горизонтально, когда нижняя часть волос заметно отличается по цвету от верхней. Может использоваться несколько оттенков, главный критерий – плавный переход от цвета к цвету и заметно отличающиеся по цвету корни и кончики.

Мастера салона «Маратти» готовы создать неповторимый и яркий образ с использованием самых щадящих техник окрашивания. Вы будут выглядеть не хуже любой красотки с экрана, ведь к вашим услугам все передовые технологии по доступным ценам!

4 СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ | Paul Mitchell®

Цель семинара-практикума: узнать о всех тонкостях работы с осветляющими продуктами Paul Mitchell и на практике отработать 4 самые популярные техники окрашивания.

НА СЕМИНАРЕ ВЫ УЗНАЕТЕ:

• Как правильно выбрать технику для клиента: как правильно провести консультацию, в каких случаях какую технику выбрать, как действовать в разных ситуациях с разным качеством волос и разным исходным цветом.
• Фоны осветления, пути их нейтрализации. Как работать с ассистентом и без, наиболее вероятные ошибки мастеров и их решение, какие инструменты и средства использовать.
• Выполнение техник растяжки цвета, создания эффекта естественных, мягких бликов: коррекция airtouch, начёс со схемами, как правильно и чем расчесать начёс, растяжка цвета и плавный переход.
• Основные способы тонирования после осветления: рецепты тонирования осветленных волос, техники тонирования и подбора оттенка.
• Техники рассветления для создания модных салонных образов на моделях (демонстрация на 2х моделях).
• Подбор грамотного домашнего ухода, как забота о клиенте.
• Второй день семинара полностью посвящен демонстрации модных текстур и отработке навыков окрашивания на моделях по схемам на красителях Paul Mitchell – The Color XG, The Demi.

ВАЖНО: С собой нужно иметь только инструменты, все расходные материалы и средства предоставляются организатором семинара.

Airtouch — это техника мелирования, предполагающая тонирование отдельных прядей в цвет, близкий к основному. Название техники, которое дословно переводится как «воздушное прикосновение», появилось благодаря особому приему: перед окрашиванием выбранные пряди «раздуваются» струей воздуха из фена.

Мелирование — процедура окрашивания волос, включающая покраску лишь нескольких прядей. Правильно выполненное окрашивание придает волосам блеск и объем, а также прекрасно вписывается в общую цветовую гамму волос.

Шатуш, или окрашивание с применением техники начеса – ещё одна вариация осветления отдельных прядей в один или несколько оттенков, но с ключевым нюансом: переход цветов происходит по горизонтали.

Балаяж — техника окрашивания волос, создающая впечатление “выгоревших на солнце прядей”. Такое окрашивание визуально увеличивает объем волос и создаёт эффектную “глубину”.

ПРОГРАММА СЕМИНАРА:

1й ДЕНЬ:

• теоретическая информация по диагностике волос
• подбор техники окрашивания
• составление рецепта окрашивания

2й ДЕНЬ:

• отработка на моделях

Все участники семинара получают скидки на продукцию и приятные подарочки от Paul Mitchell.

ПЛЮС кофе-брейк с вкусняшками и шуточки от Art-директора обязательно прилагаются 😉

СЕМИНАР ВЕДЕТ:

Кирилл Черкасов – Арт-директор PAUL MITCHELL в Украине, имеет свой уникальный, наработанный годами опыт в окрашивании волос любой длины и состояния.

«Исправлять, делать коррекции, нейтрализации – это не сложно!»

Hairdresser и эксперт по стилю шоу-программ на ТВ, на его счету несколько открытых салонов красоты и колоссальный практический опыт работы с продуктами американского бренда Paul Mitchell в Украине и за рубежом, является автором уникальных лечебных методик MarulaOil и Duo-ламинирование, участник FashionWeek UA.

Airtouch, аир тач по низкой цене в Ростове на Западном

/
Статьи /
Техника окрашивания Airtouch для разных типов волос

Особенности окрашивания Airtouch

Новая техника окрашивания Airtouch имеет общие черты с мелированием. Она сочетает в себе окрашивание по типу мелирования с обдуванием окрашенных волос феном.
Поток воздуха выдувает из прядей волосы, и переход цвета получается более плавным. Нет четкой границы между прядями разных оттенков. Результат окрашивания аир тач – более объемный оттенок и переливающиеся на свету волосы.

Название Airtouch, прикосновение воздуха, происходит непосредственно от техники выполнения. Дуновение воздуха от фена выводит привычное мелирование на совершенно новый уровень.

Мастера салона красоты Верди одними из первых в Ростове-на-Дону начали использовать новую технику Airtouch в своей практике. В салоне Верди используются профессиональные средства, которые дополнительно защищают волосы и предотвращают нежелательную желтизну.

окрашивание Airtouch в салоне Верди, Ростов-на-Дону

Мастера подбирают такие сочетания оттенков, которые смотрятся при окрашивании Airtouch наиболее гармонично и естественно.
Для Airtouch можно выбрать любое сочетание цветов в зависимости от пожеланий клиента. Можно окрашивать в новой технике и натуральные, и ранее окрашенные волосы. Если за основу берется натуральный цвет волос, то корни волос можно не задействовать при окрашивании. Это важно для проблемных волос и чувствительной кожи головы.

Преимущества окрашивания аир тач

Преимущества мелирования Airtouch:

• модный и стильный результат;
• эффект омоложения;
• мягкий естественный вид волос;
• бережное воздействие на волосы.

Если в качестве основного оттенка остается натуральный цвет волос, то не требуется частой коррекции или обновления. На длинные волосы достаточно делать аир тач один раз в 4 – 6 месяцев.
Аир тач подходит девушкам и женщинам любого возраста, с любым натуральным цветом волос.

Женщины зрелого возраста, которые не решались на контрастное мелирование, с удовольствием применяют новую технику окрашивания. То же самое относится к женщинам, соблюдающим строгий дресс-код. Волосы после окрашивания аир тач выглядят натурально, но стильно, современно и нескучно.

Airtouch на темные волосы

Аир тач на темных волосах должен выглядеть без контраста, с плавными переливами.
Так для окрашивания шатенок выбирают ореховый, карамельный оттенки, цвет кофе с молоком.

Airtouch на темные волосы

На черные волосы редко делают аир тач, это сложная задача для мастера. Однако при профессиональном подходе можно применить данную технику и для брюнеток.

Airtouch на светлые и русые волосы

Для осуществления техники аир тач для блондинок пряди волос затемняются.

Airtouch на светлые волосы

На русых волосах используют и светлые, и темные оттенки. Чаще всего осветляют пряди на два-три тона светлее натурального цвета волос.

Аир тач на короткие и средние волосы

На коротких волосах эффектно будут смотреться яркие контрастные оттенки. На очень коротких стрижках аир тач не получится. Можно применить технику на удлиненном каре или прическе боб.

На средних волосах больше простора для применения Airtouch. Окрашивание отлично смотрится на градуированных стрижках.

Airtouch на средние волосы

Аир тач на длинные волосы

Длинные прямые волосы идеальны для реализации техники аир тач.

Airtouch на длинные волосы

На длинных волосах наиболее заметны все преимущества аи Airtouch . Мастер может применить только аир тач или совместить несколько техник окрашивания.

Чем мелирование Airtouch отличается от омбре

При выполнении омбре нижняя часть волос прокрашивается полностью. При этом оттенок краски берется более контрастный, чтобы переход между цветами был заметен на волосах. Омбре придает эффект градиента по вертикали.
В технике Airtouch цвет получается более размытым, четких контуров не заметно. Градиент цвета получается больше по горизонтали, чем по вертикали.

Где покрасить волосы в технике Airtouch в Ростове-на-Дону

Адреса и телефоны салонов VERDI в Ростове-на-Дону на Западном

Окрасить волосы в новейшей технике аир тач у лучших мастеров Ростова-на-Дону приглашает салон красоты Верди. Наши мастера проходят непрерывное обучение, постоянно осваивают новинки в области окрашивания волос и предлагают все самое лучшее своим клиентам.

Дифференциальные методы окрашивания — Микробиология: лабораторный опыт

Просмотр бактериальных клеток

Микроскоп — очень важный инструмент в микробиологии, но есть ограничения, когда дело доходит до его использования для наблюдения за клетками в целом и бактериальными клетками в частности. Двумя наиболее важными проблемами являются разрешение и контраст. Разрешение — это ограничение, с которым мы ничего не можем поделать, поскольку большинство бактериальных клеток уже приблизились к пределу разрешения большинства световых микроскопов.Тем не менее, контраст можно улучшить либо с помощью оптической системы другого типа, такой как фазовый контраст или микроскоп с дифференциальным интерференционным контрастом, либо путем окрашивания клеток (или фона) хромогенным красителем, который не только добавляет контраст, но и дает им тоже цвет.

В микробиологии используется множество различных красителей и процедур окрашивания. Некоторые включают одно пятно и всего несколько шагов, в то время как другие используют несколько пятен и более сложную процедуру. Перед тем, как начать процедуру окрашивания, клетки необходимо закрепить (размазать) и зафиксировать на предметном стекле.

Бактериальный мазок — это просто небольшое количество культуры, растекающееся в виде очень тонкой пленки на поверхности предметного стекла. Чтобы предотвратить вымывание бактерий во время этапов окрашивания, мазок может быть химически или физически «прикреплен» к поверхности предметного стекла. Тепловая фиксация — простой и эффективный метод, который достигается путем кратковременного пропускания предметного стекла через пламя горелки Бунзена, в результате чего биологический материал становится более или менее прочно прикрепленным к поверхности стекла.

Термофиксированные мазки готовы к окрашиванию. При простом окрашивании в мазок добавляются красители, которые либо притягиваются зарядом (катионный краситель, такой как метиленовый синий или кристаллический фиолетовый), либо отталкиваются зарядом (анионный краситель, такой как эозин или тушь). Катионные красители связывают бактериальные клетки, что хорошо видно на ярком фоне. Анионные красители отталкиваются клетками, поэтому клетки становятся яркими на окрашенном фоне. Примеры того и другого см. На рисунках 1 и 2.

Рис. 1. Отрицательная окраска инкапсулированных дрожжей Cyptococcus neoformans
Рис. 2. Положительное окрашивание на Staphylococcus aureus.

Вероятно, наиболее важной особенностью, которая становится очевидной при окрашивании бактериальных клеток, является их клеточная морфология (не путать с морфологией колоний, которая представляет собой появление бактериальных колоний на чашке с агаром). Большинство гетеротрофных и культивируемых бактерий имеют несколько основных форм: сферические клетки (кокки / кокки), палочковидные клетки (палочки / бациллы) или палочковидные клетки с изгибами или изгибами (вибрионы и спириллы соответственно).Существует большее разнообразие форм среди архей и других бактерий, встречающихся в экосистемах, отличных от человеческого тела.

Часто бактерии создают определенные структуры клеток, которые образуются в результате бинарного деления бактериями во время их размножения. Устройства особенно очевидны с неподвижными бактериями, потому что клетки имеют тенденцию оставаться вместе после завершения процесса деления. И форма, и расположение клеток являются характеристиками, которые можно использовать для различения бактерий.Наиболее часто встречающиеся формы бактерий (кокки и бациллы) и их возможное расположение показаны на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3. Возможное расположение бактериальных клеток для кокков.

Рисунок 4. Возможное расположение бактериальных клеток для бацилл.

Дифференциальные методы окрашивания

В микробиологии методы дифференциального окрашивания используются чаще, чем простые окрашивания, как средство сбора информации о бактериях. Методы дифференциального окрашивания, которые обычно требуют более одного окрашивания и нескольких этапов, называются таковыми, потому что они позволяют дифференцировать типы клеток или клеточные структуры.Наиболее важным из них является окраска по Граму. Другие методы дифференциального окрашивания включают окрашивание эндоспор (для выявления бактерий, образующих эндоспоры), кислотостойкое окрашивание (для отличия видов Mycobacterium от других бактерий), метахроматическое окрашивание для определения гранул, накапливающих фосфат, и окрашивание капсул (для идентификации инкапсулированные бактерии). Мы будем выполнять процедуры окрашивания по Граму и эндоспор в лаборатории, а также просматривать подготовленные слайды, которые выделяют некоторые другие клеточные структуры, присутствующие у некоторых бактерий.

Краска по грамму

Рисунок 5. Бактерии, окрашенные по Граму.

В 1884 году врач Ганс Кристиан Грам изучал этиологию (причину) респираторных заболеваний, таких как пневмония. Он разработал процедуру окрашивания, которая позволила ему идентифицировать бактерии в легочной ткани, взятой у умерших пациентов, как этиологический агент фатальной пневмонии. Хотя метод окрашивания по Граму мало помог в лечении болезни, он значительно упростил диагностику причины смерти человека при вскрытии.Сегодня мы используем методы окрашивания по Граму, чтобы помочь в идентификации бактерий, начиная с предварительной классификации на одну из двух групп: грамположительных или грамотрицательных .

Дифференциальная природа окраски по Граму основана на способности некоторых бактериальных клеток сохранять первичную окраску (кристаллический фиолетовый), сопротивляясь процессу обесцвечивания. Окрашивание по Граму включает четыре этапа. Сначала клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым с последующим добавлением фиксирующего агента для окрашивания (йода).Затем применяется спирт, который выборочно удаляет пятно только с грамотрицательных клеток. Наконец, добавляется вторичный краситель, сафранин, который окрашивает обесцвеченные клетки в розовый цвет.

Хотя Грам не знал этого в то время, основное различие между этими двумя типами бактериальных клеток — это их клеточные стенки. Стенки грамотрицательных клеток имеют внешнюю мембрану (также называемую оболочкой), которая растворяется во время мытья спиртом. Это позволяет ускользнуть кристально-фиолетовому красителю. Только обесцвеченные клетки поглощают розовый краситель сафранин, что объясняет разницу в цвете между двумя типами клеток.По завершении процедуры окрашивания по Граму грамположительные клетки выглядят пурпурными, а грамотрицательные — розовыми.

При интерпретации мазка, окрашенного по Граму, необходимо также описать морфологию (форму) клеток и их расположение. На рисунке 5 представлены два различных типа бактерий, которые можно различить по реакции окрашивания по Граму, а также по их форме и расположению. Ниже опишите эти характеристики для обеих бактерий:

Кислотостойкое пятно

Некоторые бактерии производят воскообразное вещество миколиновую кислоту , когда они конструируют свои клеточные стенки.Миколиновая кислота действует как барьер, защищающий клетки от дегидратации, а также от фагоцитоза клетками иммунной системы хозяина. Этот восковой барьер также предотвращает проникновение пятен в клетку, поэтому окрашивание по Граму не работает с микобактериями, такими как Mycobacterium , которые являются патогенами людей и животных. Для этих бактерий используется метод кислотного — быстрого окрашивания .

Рисунок 6. Кислотоустойчивые бациллы в мокроте.

Для проведения кислотостойкого окрашивания термофиксированный мазок заливают первичным красителем карбол фуксином, а предметное стекло нагревают на водяной бане с паром.Тепло «плавит» восковую клеточную стенку и позволяет клеткам поглощать краситель. Затем слайду дают остыть и добавляют раствор кислоты и спирта в качестве обесцвечивающего средства. Клетки, которые являются «кислотоустойчивыми» из-за миколовой кислоты в их клеточной стенке, сопротивляются обесцвечиванию и сохраняют первичное окрашивание. Все остальные типы клеток обесцвечиваются. Затем метиленовый синий используется в качестве контрастного красителя. В конце концов, кислотоустойчивые бактерии (AFB) будут окрашены в ярко-розовый цвет, а все другие типы клеток станут синими.

Методы окрашивания для выделения определенных клеточных структур

Капсула : полисахаридная слизь, которая окружает некоторые виды бактерий и несколько типов эукариотических микробов, лучше всего визуализируется при отрицательном окрашивании клеток. В этом методе бактерии сначала смешиваются с пятном, а затем капля смеси распределяется по поверхности предметного стекла в виде тонкой пленки. При использовании этого метода капсулы выглядят как прозрачный слой вокруг бактериальных клеток с темным фоном.

Метахроматический гранулы или другие внутрицитоплазматические тельца : Некоторые бактерии могут содержать накопительные тельца, которые могут окрашиваться. Одним из примеров является грамположительная палочка Corynebacterium , которая накапливает фосфат в структурах, называемых «волютин», или метахроматических гранулах, находящихся внутри клеточной мембраны. Для визуализации внутрицитоплазматических тел у бактерий используются различные методы окрашивания, которые часто дают ключ к идентификации при наблюдении в клетках.

эндоспоровой Stain

Эндоспоры — это неактивные формы живых бактерий, и их не следует путать с репродуктивными спорами, продуцируемыми грибами. Эти структуры производятся несколькими видами грамположительных бактерий, почти всеми бациллами, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды. Две распространенные бактерии, продуцирующие эндоспоры, — это Bacillus или Clostridum . Оба живут в основном в почве и как симбионты растений и животных и производят эндоспоры, чтобы выжить в быстро и часто меняющейся среде.

Процесс эндоспоруляции (образование эндоспор) включает несколько этапов. После того, как бактериальная клетка реплицирует свою ДНК, образуются слои пептидогликана и белка, окружающие генетический материал. После полного образования эндоспора высвобождается из клетки и может бездействовать в течение нескольких дней, недель или лет. Когда преобладают более благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры прорастают и возвращаются к активной работе в качестве вегетативных клеток.

Зрелые эндоспоры обладают высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, таким как тепло и химические вещества, и это позволяет бактериям выжить в течение очень долгого времени. Эндоспоры, образовавшиеся миллионы лет назад, были успешно возвращены к жизни, просто обеспечив их водой и пищей.

Поскольку оболочка эндоспор очень устойчива к окрашиванию, был разработан специальный метод, чтобы их было легче увидеть в светлопольном микроскопе. Этот метод, называемый «краситель эндоспор » , использует либо нагревание, либо длительное время воздействия, чтобы побудить эндоспоры принять первичное пятно, обычно водорастворимый краситель, такой как малахитовый зеленый, поскольку эндоспоры проницаемы для воды.После этапа обесцвечивания, который удаляет краситель из вегетативных клеток в мазке, наносится контрастирующий сафранин для обеспечения цвета и контраста. При окрашивании этим методом эндоспоры становятся зелеными, а вегетативные клетки окрашиваются в розовый цвет, как показано на Рисунке 7.

Рисунок 7. Бактериальные клетки с эндоспорами, окрашенные методом окраски эндоспор. Рисунок 8. Бациллы с эндоспорами, просматриваемые с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Хотя сами эндоспоры устойчивы к методу окрашивания по Граму, бактериальные клетки, захваченные в процессе создания этих структур, можно окрашивать.В этом случае эндоспоры выглядят как четкие овальные или сферические области внутри окрашенной клетки. Эндоспоры также можно непосредственно наблюдать в клетках с помощью фазово-контрастной микроскопии, как показано на Рисунке 8.

Поскольку многие методы дифференциального окрашивания требуют нескольких этапов и длительного времени, мы не будем выполнять все методы дифференциального окрашивания, описанные выше.

Предварительно окрашенные слайды будут использоваться для визуализации бактериальных капсул, метахроматических гранул и кислотоустойчивых бацилл.Возьмите по одному слайду каждой из трех бактерий, перечисленных в таблице ниже. Просматривая эти слайды, обращайте внимание на «выделенные» структуры. Ваш экологический изолят может иметь одну или несколько из этих клеточных функций, и умение распознавать их поможет в идентификации. Все это следует рассматривать с помощью масляного иммерсионного объектива.

Пятно по грамму

Все процедуры окрашивания следует проводить над раковиной.Будет продемонстрирована процедура окрашивания по Граму, а обзор представлен в таблице 1.

Таблица 1. Этапы процедуры окрашивания по Граму.
Шаг	Процедура	Результат
Первичная окраска (кристально-фиолетовый)	Добавьте несколько капель кристаллического фиолетового в мазок и оставьте на 1 минуту. Промойте предметное стекло водой.	И грамположительные, и грамотрицательные клетки будут окрашены в пурпурный цвет кристаллическим фиолетовым красителем.
Протрава (йод)	Добавьте несколько капель йода в мазок и оставьте на 1 минуту. Промойте предметное стекло водой.	Йод «устанавливает» кристаллический фиолетовый цвет, поэтому оба типа бактерий остаются фиолетовыми.
Обесцвечивание (этанол)	Добавьте капли этанола одну на a время , пока сток не станет прозрачным.Промойте предметное стекло водой.	Грамположительные клетки сопротивляются обесцвечиванию и остаются фиолетовыми. Краситель высвобождается из грамотрицательных клеток.
Контрастн (сафранин)	Добавьте несколько капель сафранина в мазок и оставьте на одну минуту. Промойте предметное стекло водой и промокните насухо.	Грамотрицательные клетки будут окрашены сафранином в розовый цвет. Этот краситель не действует на грамположительные клетки, которые остаются фиолетовыми.

Доброволец из вашего лабораторного стола должен получить культуры бактерий, которые вы будете использовать в этой лаборатории, в соответствии с указаниями вашего инструктора.Одна из культур будет грамположительной бактерией, а другая — грамотрицательной. Ниже напишите названия бактерий, которые вы будете использовать, вместе с BSL для каждой культуры:

__________________________________________________________________________________

Возьмите два предметных стекла и приготовьте мазок каждой из двух бактериальных культур, по одному на предметное стекло, как показано. Дайте ПОЛНОСТЬЮ высохнуть на воздухе и закрепите при нагревании. Покрасьте оба мазка методом окраски по Граму.Наблюдайте за предметными стеклами с помощью светового микроскопа при увеличении в 1000 раз и запишите свои наблюдения в таблице ниже.

Пятно по Граму «Заключительный осмотр»: приготовьте мазок, содержащий смесь грамположительных И грамотрицательных бактерий, добавив небольшое количество каждой бактерии в одну каплю воды на предметном стекле. Тепло зафиксируйте мазок и окрасите его по Граму. Вы должны быть в состоянии определить реакцию окрашивания по Граму, клеточную морфологию и расположение ОБЕИХ бактерий в этом смешанном мазке. Ваш инструктор может попросить показать этот слайд и предложить конструктивный комментарий.

эндоспоровой Stain

Лишь несколько родов бактерий продуцируют эндоспоры, и почти все они являются грамположительными бациллами. Наиболее заметными являются виды Bacillus и Clostridium , которые естественным образом обитают в почве и являются обычными загрязнителями на поверхности.Рост Clostridium spp. обычно ограничивается анаэробной средой; Bacillus spp. может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эндоспорообразующие бактерии отличаются от других групп грамположительных бацилл и различимы по их эндоспорам.

Обзор процедуры окрашивания эндоспор представлен в таблице 2.

Таблица 2. Этапы процедуры окрашивания эндоспор.
Шаг	Процедура	Результат
Первичная морилка (малахитовый зеленый)	Добавьте несколько капель малахитового зеленого в мазок и оставьте на 10 минут.Если пятно начинает высыхать, добавьте дополнительные капли.	Вегетативные клетки немедленно поглощают первичную окраску. Эндоспоры устойчивы к окрашиванию, но со временем поглощают краситель.
Обесцвечивание (вода)	Промойте предметное стекло под слабой струей воды в течение 10-15 секунд.	После окрашивания эндоспоры остаются зелеными. Тщательное ополаскивание водой обесцвечивает вегетативные клетки.
Контрастн (сафранин)	Добавьте несколько капель сафранина в мазок и оставьте на 1 минуту.Промойте предметное стекло и промокните насухо.	Обесцвеченные вегетативные клетки принимают контрастное пятно и становятся розовыми; эндоспоры светло-зеленые.

После окрашивания эндоспоры обычно выглядят как светло-зеленые овальные или сферические структуры, которые можно увидеть внутри или за пределами вегетативных клеток, которые выглядят розовыми.

Форма и расположение эндоспор внутри бактериальных клеток, а также то, расширяет ли спорангий (D) или не расширяет (ND) стороны клетки, являются важными характеристиками, которые помогают в дифференциации между видами (см. Рисунок 9) .

Рисунок 9

1. Овальный, центральный, не растянутый (ND)
2. Овальный, концевой, ND (и параспоральный кристалл)
3. Овальный, концевой, растянутый (D)
4. Овальный, центральный, D
5. Сферический, концевой, D
6. Овальный, боковой, D

Эндоспоры довольно устойчивы к большинству процедур окрашивания; однако в мазках с обычным окрашиванием они могут быть видны как «очертания» с чистым пространством внутри. Если вы наблюдаете «очертания» или то, что кажется «призраками» клеток в мазке, окрашенном по Граму, грамположительных бацилл, то также следует выполнить окрашивание эндоспор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие эндоспор.

Волонтер из вашего лабораторного стола должен получить бактериальные культуры для окрашивания эндоспор в соответствии с указаниями вашего инструктора. Обратите внимание, что все это будут виды Bacillus . Приготовьте мазки и окрасьте каждый, используя технику окрашивания эндоспор. Посмотрите на слайды и отметьте форму и расположение эндоспоры, а также внешний вид спорангия (опухший или не опухший) в таблице ниже:

Кроме того, выберите ОДНУ из указанных выше культур и окрасите ее по Граму.Запишите свои результаты ниже в отведенных местах:

Название культуры, окрашенной по Граму: __________________________________________________

Реакция окрашивания по Граму и клеточная морфология: ______________________________________

Видны ли эндоспоры в мазке, окрашенном по Граму? _________________ Если вы видите эндоспоры, опишите, как они выглядят в препарате, окрашенном по Граму, и чем он похож и отличается от того, что вы видите в препарате, окрашенном по Граму.

Принцип, процедура, интерпретация, примеры и анимация

Окрашивание по Граму — это распространенный, важный и наиболее часто используемый метод дифференциального окрашивания в микробиологии, который был введен датским бактериологом Гансом Кристианом Грамом в 1884 году. Этот тест позволяет дифференцировать бактерии на грамположительные и Грамотрицательные бактерии, которые помогают в классификации и дифференциации микроорганизмов.

Принцип окрашивания по Граму

Когда бактерии окрашиваются первичным красителем Crystal Violet и фиксируются протравой, некоторые из бактерий способны удерживать первичное окрашивание, а некоторые обесцвечиваются спиртом.Клеточные стенки грамположительных бактерий имеют толстый слой белково-сахарных комплексов, называемых пептидогликаном, и низкое содержание липидов. Обесцвечивание клетки заставляет эту толстую клеточную стенку обезвоживаться и сжиматься, что закрывает поры в клеточной стенке и предотвращает выход пятна из клетки. Таким образом, этанол не может удалить комплекс кристаллического фиолетового и йода, который связан с толстым слоем пептидогликана грамположительных бактерий и имеет синий или фиолетовый цвет.

В случае грамотрицательных бактерий клеточная стенка также поглощает комплекс CV-йод, но из-за тонкого слоя пептидогликана и толстого внешнего слоя, который сформирован из липидов, комплекс CV-йод смывается.Когда они подвергаются воздействию алкоголя, обесцвечивающее средство растворяет липиды в клеточных стенках, что позволяет комплексу кристаллический фиолетовый-йод вымываться из клеток. Затем при повторном окрашивании сафранином они забирают пятно и приобретают красный цвет.

  Реагенты, используемые при окрашивании по Граму  

• Кристаллический фиолетовый, первичное окрашивание
• Йод, протрава
• Обесцвечивающее средство на основе ацетона и спирта (95%)
• Сафранин, контрастное окрашивание по Граму

9000ram4 Окрашивание

1. Возьмите чистое, обезжиренное предметное стекло.
2. Приготовьте мазок суспензии на чистом предметном стекле с петлей образца.
3. Сушка на воздухе и закрепление нагреванием
4. Кристаллический фиолетовый залили и выдержали от 30 секунд до 1 минуты, затем смойте водой.
5. Залейте грамм йодом в течение 1 минуты и промойте водой.
6. Затем промойте 95% спиртом или ацетоном в течение 10-20 секунд и смойте водой.
7. Добавьте сафранин примерно на 1 минуту и ​​промойте водой.
8. Высушите на воздухе, промокните и исследуйте под микроскопом.

  Интерпретация  

грамположительных: синий / фиолетовый цвет
грамм отрицательных: красный цвет

  Примеры  

грамположительных бактерий: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Clostridium , Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces и др.
Грамотрицательные бактерии: Escherichia coli ( E. coli ), Salmonella , Shigella и другие Enterobacteriaceae, Pseudomonas , Moraxella , Helicobacter , Stenotrophomonas , Bdellovibrio , уксуснокислые бактерии

065,

Legionella 2 и т.

Загрузите анимацию снизу:
Анимация окрашивания по Граму

Лист технических данных метода окрашивания Райта

Номер по каталогу EMS: 26060

Фиксация:

Тонкая полоска (толщиной примерно в одну ячейку) размазывается по стерильному предметному стеклу с помощью второго предметного стекла или покровного стекла.Быстро сохнет на воздухе.

Окрашивание:

1. Нанесите 1,0 мл раствора для окрашивания Райта на мазок на 1–3 минуты.
2. Добавьте 2,0 мл дистиллированной воды или фосфатного буфера pH 6,5 и дайте постоять в два раза дольше, чем на шаге 1.
3. Промойте окрашенный мазок водой или фосфатным буфером pH 6,5, пока края не станут слегка розовато-красными.
4. Для окрашивания внешнего вида по Гимзе 10 минут в одном объеме красителя Райта и 4 объемах фосфатного буфера, pH 6.5.
5. Промокните очень осторожно. Окрашивание может быть скорректировано путем дальнейшего разбавления или по времени до или после разбавления в описанной выше процедуре.

Результатов:

Артикул:

Conn, J. I Biological Stains, 8-е изд., Уильямс и Уилкинс Ко. Балтимор, 1969.

Кларк, Г. (ред.) Процедуры окрашивания, Уильямс и Уилкенс Ко., Балтимор, 3-е изд., C 1972, стр. 122

Онлайн-заказ

Райт
Stain Solution доступен онлайн в каталоге EMS.
Для заказа или получения информации о продукте щелкните
Вот.

Лист технических данных Neat Stain

Сводка

Для окрашивания бактерий из культур или образцов пациентов методом дифференциальной окраски по Граму.Эта процедура основана на модификации Hucker оригинального метода окрашивания по Граму. И грамположительные, и грамотрицательные бактерии окрашиваются кристаллическим фиолетовым. Добавление йода приводит к образованию кристаллического фиолетово-йодного комплекса внутри клеточной стенки. Обесцвечивающее средство извлекает липиды из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, тем самым увеличивая пористость клеточной стенки и позволяя комплексу кристаллический фиолетовый-йод диффундировать из клетки. В то же время грамположительные бактерии обезвоживаются, что приводит к уменьшению пористости клеточной стенки и захвату комплекса кристаллический фиолетовый и йод внутри клетки.Из-за увеличения пористости контрастное краситель сафранин может проникать через клеточную стенку грамотрицательных бактерий.

Условия хранения

Хранить при контролируемой комнатной температуре (15-30 ° C) в плотно закрытых флаконах. Пакеты с реагентами для окрашивания Neat Stain Gram могут быть повторно запечатаны с помощью прилагаемой полоски фольги на липкой основе между использованиями. Не использовать после истечения срока годности, указанного на упаковке с реагентом.

Признаки ухудшения

Если в растворе кристально-фиолетового образуется осадок, осторожно нагрейте до 37 ° C и хорошо встряхните для повторного растворения.

Сбор и подготовка образцов

Жидкая среда: Нанесите суспензию бактерий на чистое предметное стекло с помощью стерилизованной проволочной петли и дайте высохнуть на воздухе. Закрепите пятна нагреванием, пропустив предметное стекло через пламя три раза и дайте ему остыть.

Твердый носитель: поместите полную петлю деионизированной воды на чистое предметное стекло. Прикоснитесь к колонии стерилизованной проволочной петлей и подвесьте клетки в капле воды; распределите суспензию на слайде и дайте высохнуть на воздухе.Закрепите мазок нагреванием, трижды пропустив предметное стекло через пламя, и дайте ему остыть.

Пациент: возьмите образец пациента с помощью стерильной проволочной петли, пипетки или тампона. Нанесите образец на чистое предметное стекло и дайте ему высохнуть на воздухе. Закрепите мазок нагреванием, трижды пропустив предметное стекло через пламя, и дайте ему остыть.

Техника

Погрузите подготовленное предметное стекло в камеру 1 (кристально-фиолетовое пятно) на одну минуту. Осторожно промойте предметное стекло деионизированной водой.Погрузите предметное стекло в камеру 2 (раствор стабилизированного йода) примерно на две минуты. Осторожно промойте предметное стекло деионизированной водой. Несколько раз окуните предметное стекло в камеру 3 (обесцвечивающее средство), проверяя между каждым погружением. Обесцвечивание завершено, как только раствор вытечет из мазка на предметном стекле. Осторожно промойте предметное стекло деионизированной водой. Погрузите предметное стекло в камеру 4 (Сафранин) на одну минуту. Осторожно промойте предметное стекло деионизированной водой и промокните предметным стеклом абсорбирующей бумагой. Изучите слайд соответствующим образом.

Результаты

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — от розового до красного.

Ограничения процедуры

Применение чрезмерного тепла во время фиксации мазка может привести к разрыву стенок бактериальных клеток и повлиять на результаты окрашивания по Граму. Лечение антибактериальными препаратами может привести к появлению грамположительных бактерий.

Контроли

: Характеристики набора можно проверить с помощью следующей процедуры: Окрашивают подготовленное предметное стекло Staphylococcus aureus из 18–24-часовой культуры красителем кристально-фиолетового цвета, выдерживая в течение одной минуты и промывая деионизированной водой. Следует наблюдать грамположительные пурпурные кокки; если нет, откажитесь от этого решения.

Окрашивают подготовленное предметное стекло Escherichia coli из 18–24-часовой культуры с помощью Safranin Stain, давая постоять в течение одной минуты и поднимаясь с помощью деионизированной воды. Должны наблюдаться грамотрицательные розовые палочки; если нет, откажитесь от этого решения.

Следуя обычной процедуре окрашивания по Граму, окрасьте подготовленное предметное стекло S. aureus из 18–24-часовой культуры. Следует наблюдать грамположительные пурпурные кокки; в противном случае откажитесь от раствора грамма йода.

Меры предосторожности

Кристально-фиолетовый: вызывает раздражение глаз. После работы тщательно вымыть. В случае попадания в глаза промыть глаза водой в течение 15 минут. Обратитесь к врачу.

Йод: вызывает раздражение глаз. После работы тщательно вымыть. В случае попадания в глаза промыть глаза водой в течение 15 минут. Обратитесь к врачу.

Обесцвечивающее средство: Чрезвычайно легко воспламеняется. Используйте при соответствующей вентиляции. Избегайте чрезмерного нагрева, искр и открытого огня. Обесцвечивающее средство вызывает раздражение глаз.После работы тщательно вымыть. В случае попадания в глаза промыть глаза водой в течение 15 минут. Обратитесь к врачу.

Сафранин: горючая жидкость. Избегайте чрезмерного нагрева, искр и открытого огня. Вызывает раздражение глаз. После работы тщательно вымыть. В случае попадания в глаза промыть глаза водой в течение 15 минут. Обратитесь к врачу.

Ограниченная гарантия

Этот продукт имеет гарантию на работу в соответствии с описанием на этикетке и в документации по продукту.Electron Microscopy Sciences, Inc. отказывается от всех других гарантий, явных, подразумеваемых и установленных законом в отношении этого продукта, включая, помимо прочего, гарантию пригодности для определенной цели и гарантию товарной пригодности. Ни при каких обстоятельствах компания Electron Microscopy Sciences, Inc. или любая из ее дочерних компаний не несут ответственности за случайные или косвенные убытки покупателя или любой третьей стороны, как бы они ни возникли, даже если они были уведомлены о таких убытках.

Онлайн-заказ

Набор для окрашивания по граммам Neat Stain доступен в Интернете в каталоге EMS.Для заказа или информации о продукте щелкните здесь.

Микроскопия и окрашивание: окрашивание по граммам, капсулам и эндоспорам

Бактерии — это микроскопические живые организмы, которые обладают многими отличительными характеристиками, такими как форма, расположение клеток, образуют ли они капсулы или нет, и образуют ли они споры. Все эти особенности можно визуализировать путем окрашивания, что помогает идентифицировать и классифицировать различные виды бактерий.

Чтобы изучить первые две характеристики формы и расположения клеток, мы можем использовать простой метод, называемый окрашиванием по Граму. Здесь кристаллический фиолетовый применяется к бактериям, которые были закреплены на предметном стекле. Затем наносится обесцвечивающее средство, и любые бактерии с толстым пептидогликановым слоем окрашиваются в фиолетовый цвет, так как обесцвечивающее средство не может легко проникнуть в этот слой. Эти бактерии называются грамположительными.

Грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой пептидогликана и обесцвечивают обесцвечивающее средство, теряя пурпурный цвет. Тем не менее, они будут окрашиваться в красновато-розовый цвет при добавлении контрацептора сафранина, который связывается со слоем липополисахарида на их внешней стороне.После окрашивания клетки можно наблюдать на предмет морфологии, размера и расположения, например, в цепочках или кластерах, что дополнительно помогает в классификации и идентификации.

Другой полезный метод в наборе инструментов микробиолога — это окрашивание капсул, используемое для визуализации внешних капсул, окружающих некоторые типы бактериальных клеток. Из-за неионного состава капсул и их способности отталкивать пятна простые методы окрашивания не работают. Вместо этого используется метод негативного окрашивания, при котором сначала окрашивается фон кислотным красителем, таким как Конго красный, прежде чем бактериальные клетки окрашиваются кристаллическим фиолетовым.Это оставляет любую капсулу в виде четкого ореола вокруг клеток.

Последний основной метод окрашивания, описанный здесь, может помочь определить, образуют ли исследуемые бактерии споры. В неблагоприятных условиях некоторые бактерии образуют эндоспоры, спящие, жесткие, не репродуктивные структуры, основная функция которых заключается в обеспечении выживания бактерий в периоды стресса окружающей среды, например экстремальных температур или обезвоживания. Однако не все виды бактерий образуют эндоспоры, и их трудно окрашивать стандартными методами, поскольку они непроницаемы для многих красителей.В методе Шеффера-Фултона используется окраска малахитовым зеленым, которую наносят на бактерии, зафиксированные на предметном стекле. Затем предметное стекло промывают водой перед контр-окрашиванием сафранином. Вегетативные клетки будут розовато-красными, а эндоспоры — зелеными. Из этого видео вы узнаете, как применять эти распространенные методы окрашивания бактерий, а затем исследовать образцы окрашивания с помощью световой микроскопии.

Чтобы начать процедуру, соберите длинные волосы назад и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки.

Затем очистите свежее предметное стекло микроскопа лабораторной салфеткой. Затем нанесите пипеткой 10 микролитров 1X фосфатно-солевого буфера на первое предметное стекло. Затем используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы выбрать одну бактериальную колонию из чашки с агаром LB. Смажьте бактериальные колонии в жидкости, чтобы получить тонкий ровный слой. Установите слайд на стол и дайте ему полностью высохнуть на воздухе.

После высыхания зажгите горелку Бунзена, чтобы разморозить бактерии. Используя щипцы, пропустите предметное стекло через пламя горелки несколько раз бактериальной стороной вверх, стараясь не держать предметное стекло в пламени слишком долго, что может исказить клетки.

Теперь, работая над раковиной, удерживайте предметное стекло на уровне и нанесите несколько капель кристаллического фиолетового Грама, чтобы полностью покрыть бактериальный мазок, а затем поместите предметное стекло на стол, чтобы оно оставалось на 45 секунд. Затем, удерживая предметное стекло под углом, аккуратно нанесите струю воды на верхнюю часть предметного стекла, стараясь не разбрызгивать непосредственно бактериальный мазок. Теперь, снова удерживая слайд на уровне, нанесите раствор йода Грама, чтобы полностью покрыть окрашенные бактерии, а затем дайте ему постоять еще 45 секунд.Затем осторожно смойте йод с предметного стекла, как показано ранее. Удерживая предметное стекло под углом, добавьте на предметное стекло несколько капель обесцвечивающего средства по Граму, позволяя ему стечь по окрашенным бактериям примерно на 5 секунд до тех пор, пока стекло не станет прозрачным. Немедленно промойте водой, как показано ранее. Это предотвратит чрезмерное обесцвечивание мазка. Затем, снова удерживая уровень предметного стекла, нанесите контркраску сафранином Грама, чтобы полностью покрыть окрашенные бактерии. Через 45 секунд осторожно промойте сафранин с предметного стекла водой, как показано ранее, а затем промокните насухо бумажными полотенцами.

Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла непосредственно на предметное стекло, а затем исследуйте предметное стекло с помощью светового микроскопа с масляной линзой 100X.

Чтобы начать этот протокол окрашивания, сначала наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, а затем убедитесь, что стеклянные предметные стекла, которые будут использоваться, чистые.

Далее готовим решения. Чтобы приготовить 1% раствор кристаллического фиолетового, смешайте 0,25 грамма порошка кристаллического фиолетового с 25 миллилитрами дистиллированной воды и встряхивайте до растворения.Затем приготовьте 1% раствор конго красного, смешав 0,25 грамма порошка конго красного с 25 миллилитрами дистиллированной воды и встряхивая до растворения. Теперь нанесите на предметное стекло пипеткой 10 микролитров раствора Конго красного. Используя чистый стерильный наконечник пипетки, выберите одну бактериальную колонию из чашки с агаром LB. Затем нанесите бактериальную колонию на краситель, чтобы получился тонкий ровный слой. Полностью высушите предметное стекло на воздухе в течение 5-7 минут. Когда слайд высохнет, залейте мазок 1% кристаллическим фиолетовым, чтобы он покрыл его, и оставьте на 1 минуту.Теперь, удерживая предметное стекло под углом, осторожно обрызгайте его струей воды, стараясь не распылять бактерии напрямую. Продолжайте удерживать слайд под углом 45 градусов до полного высыхания на воздухе. Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла прямо на предметное стекло, а затем изучите предметное стекло с помощью светового микроскопа с масляным объективом 100X.

Для окрашивания эндоспор сначала приготовьте 0,5% раствор малахитового зеленого, смешав 0,125 г порошка малахитового зеленого с 25 миллилитрами дистиллированной воды, а затем встряхните раствор до растворения.Затем нанесите пипеткой 10 микролитров 1X PBS в центр предметного стекла. Затем используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы выбрать одну бактериальную колонию из чашки с агаром LB. Размажьте бактерии в жидкости, чтобы получился тонкий ровный слой. Теперь установите слайд на столешницу и дайте ему полностью высохнуть на воздухе. После высыхания зажгите горелку Бунзена, чтобы разморозить бактерии. Пропустите предметное стекло через голубое пламя горелки несколько раз бактериальной стороной вверх. Затем, когда предметное стекло остынет, поместите кусок предварительно вырезанной бумаги для линз поверх закрепленного нагреванием мазка.Затем включите конфорку на максимум и доведите до кипения стакан воды.

Пропитайте бумагу для линз раствором малахитового зеленого и, используя щипцы, поместите предметное стекло на стакан с кипящей водой для пара в течение 5 минут. Держите бумагу для линз влажной, добавляя больше красителя, по капле за раз, по мере необходимости. Затем, снова используя щипцы, возьмите предметное стекло из стакана, удалите и выбросьте бумагу для линз. Дайте слайду остыть в течение 2 минут. Работая над раковиной, держите горку под углом и аккуратно брызните струей воды на верхнюю часть горки. Теперь, удерживая слайд на уровне, нанесите сафранин, чтобы полностью закрыть слайд. Затем дайте ему постоять 1 минуту. Затем держите слайд под углом и промойте, как показано ранее. Дайте слайду высохнуть на воздухе на столе. Наконец, добавьте каплю иммерсионного масла непосредственно на предметное стекло, а затем изучите предметное стекло с помощью светового микроскопа с масляным объективом 100X.

В протоколе окрашивания по Граму могут образоваться пятна двух разных цветов. Темно-пурпурное окрашивание указывает на то, что бактерии грамположительны и сохранили окраску кристально-фиолетовым.Напротив, красновато-розовое окрашивание характерно для грамотрицательных бактерий, которые вместо этого будут окрашены контркрашением сафранина. Кроме того, после окрашивания по Граму можно визуализировать различные формы и расположение бактерий. Например, можно отличить кокки, или круглые бактерии, от палочковидных бацилл или идентифицировать бактерии, которые образуют нити, по сравнению с бактериями, которые обычно собираются в сгустки или встречаются по отдельности.

На микроскопическом изображении, окрашенном капсулой, бактериальные клетки обычно окрашиваются в фиолетовый цвет, а фон предметного стекла должен быть окрашен в темный цвет.На этом темном фоне капсулы бактерий, если они есть, будут выглядеть как четкий ореол вокруг клеток.

Наконец, при окрашивании эндоспор вегетативные клетки будут окрашены в красный цвет контрокрасителем сафранином. Если в образце присутствуют эндоспоры, они сохранят окраску малахитового зеленого цвета и будут иметь голубовато-зеленый цвет.

Safranin — Микробиологические пятна | Проведение науки

Окрашивание сафранином — это наиболее широко используемый метод окрашивания для дифференцировки клеток, клеточных анализов и культивирования стволовых клеток.Окрашивание сафранином обычно используется для количественного определения и идентификации кислого протеогликана и гликозаминогликана в хрящевых тканях. Окрашивание сафранином помогает исследователям обнаруживать не только хрящевые ткани, но и все ткани и органы тела. Ниже приведены некоторые исследовательские применения красителя сафранина.

Использование сафранина для окрашивания замороженных срезов

Сафранин — дешевый и безопасный краситель, который преимущественно использовался для окрашивания тканей растений для гистологического анализа.Затем его использовали для точной диагностики замороженных срезов базальноклеточного рака и плоскоклеточного рака. В эксперименте использовались 1,0% карбонат лития и 0,5% раствор для окрашивания сафранина, которые окрашивали кератин в темно-красный цвет, а другие структуры, такие как мышечные клетки, волосяные фолликулы, гранулы тучных клеток и сальные железы, окрашивали в розовато-красный цвет. В результате окрашивание сафранином предоставило экспериментаторам высококонтрастные слайды, которые легче анализировать под микроскопом для лучшей диагностики замороженных срезов базальноклеточного и плоскоклеточного рака.Окрашивание сафранином — наиболее многообещающий метод окрашивания, используемый для гистологического анализа и диагностики опухолевых клеток с разумной точностью.

Окрашивание сафранином для оценки избирательности делигнификации древесины грибами белой гнили

В другом исследовании окрашивание сафранином было использовано для исследования срезов микротома Cryostat древесины березы, разрушенной грибами белой гнили. В эксперименте сафранин использовался в сочетании с астра-синим.Сафранин окрашивал лигнин независимо от наличия целлюлозы, тогда как Astra-blue окрашивал целлюлозу в синий цвет только в отсутствие лигнина. Затем слайды наблюдали под световой микроскопией. Этот метод предоставил исследователям удобную и надежную процедуру скрининга, позволяющую отличить только грибы, разрушающие целлюлозу и лигнин, от грибков, разрушающих целлюлозу. Методика предложила дублерам подробный морфологический и гистологический анализ растительных клеток.

Микро-спектрофотометрическое количественное определение гликозаминогликана в срезах суставного хряща, окрашенных сафранином O

Окрашивание сафранином помогло исследователям разработать новый микроспектрофотометрический метод количественного определения гликозаминогликана в хрящевых тканях. Содержание красителя в тканях было пропорционально количеству гликозаминогликана в хрящевой матрице. С помощью газовой хроматографии и тонкослойной хроматографии был определен фиксированный отрицательный заряд, содержащийся в аналите.Окрашивание сафранином — наиболее часто используемый метод обнаружения и анализа хондрогенеза клеток.

Окрашивание по Граму

Сафранин также используется в качестве контрастного красителя при окрашивании по Граму. При окрашивании по Граму сафранин непосредственно окрашивает обесцвеченные бактерии. С помощью окрашивания сафранином грамотрицательные бактерии можно легко отличить от грамположительных.

Вышеупомянутые исследовательские применения окрашивания сафранином показывают, что область окрашивания сафранином не ограничивается только гистологией растений, но также микробиологией, онкологией, дифференцировкой стволовых клеток и артрологией.

Количественная гистопатология окрашенных тканей с использованием цветовой пространственной световой интерференционной микроскопии (cSLIM)

Наши результаты состоят из нового инструмента, cSLIM, и клинических результатов по прогнозу рака груди. Система cSLIM, которая впервые дает одновременное цветное светлое поле и количественные фазовые изображения на окрашенных слайдах, описана ниже.

Оптическая установка cSLIM

Оптическая установка cSLIM показана на рис. 1. Оптическая система построена на принципе пространственной световой интерференционной микроскопии (SLIM) ⁴⁷ .Модуль SLIM (CellVista SLIM Pro, Phi Optics, Inc.) помещается в выходной порт коммерческого микроскопа. Плоскость сопряженного изображения на выходном порте микроскопа отображается на камеру с использованием системы 4 f, образованной линзами L ₁ и L ₂ . В плоскости Фурье линзы L ₁ используется пространственный модулятор света (SLM, Boulder Nonlinear Systems) для модуляции разности фаз между рассеянным и падающим светом. Как показано на рис. 1 (c, d), используются четыре фазовых сдвига, φ = 0, π /2, π , 3 π /2 рад, и изображения интенсивности записываются камерой. за каждую смену. Комбинируя четыре изображения интенсивности ⁴⁷ , мы получаем количественное фазовое изображение, свободное от амплитудных эффектов.

В текущую систему cSLIM внесено несколько существенных изменений по сравнению с предыдущими отчетами ⁴⁷ , а именно: Во-первых, вместо объектива фазово-контрастного микроскопа, используемого в SLIM, мы используем светлопольный объектив 40x / 0,75 NA. Использование светлопольного объектива позволяет нам получать типичные светлопольные изображения, т. Е. Гистологические изображения, окрашенные H & E, которые являются основой гистопатологии в клинике.Кольцевое конденсорное кольцо сохранилось от фазово-контрастного микроскопа. Во-вторых, камера с оттенками серого заменяется камерой RGB (Carl Zeiss Axiocam MRc), которая обеспечивает красный, зеленый и синий каналы. Наконец, поскольку мы используем камеру RGB, обнаруженная фаза — это фаза суммы автокорреляционных функций для каждого спектрального канала (см. Ниже). В результате калибровка SLM и физический смысл измеренной фазы отличаются от предыдущих отчетов.

Для каждого фазового сдвига мы получаем три кадра интенсивности, соответствующие красному, зеленому и синему каналам камеры: R ( x , y ; φ ), G ( x , y ; φ ) и B ( x , y ; φ ) соответственно.В каждом случае эти каналы комбинируются линейно для получения эквивалентного изображения в градациях серого, как

$$ I (x, y; \ phi) = rR (x, y; \ phi) + gG (x, y; \ phi ) + bB (x, y, \ phi), $$

(1)

, где r , g , b — константы, такие что r + g + b = 1. В рукописи мы используем r = 0,1, g = 0,6, b = 0,3. Это взвешивание было определено эмпирически, поскольку оно определяет эквивалентную центральную длину волны λ _c , на которой происходит фазовая модуляция с помощью SLM.Чтобы описать помехи, возникающие в результате наложения трех спектральных каналов, мы начнем с эквивалентного спектра для визуализации cSLIM, а именно

$$ {S} _ {c} (\ omega) = {S} _ {i} (\ omega) [{S} _ {R} (\ omega) + {S} _ {G} (\ omega) + {S} _ {B} (\ omega)] $$

(2)

, где ω — оптическая угловая частота, S _i — спектр падающего света и S _R , S _G и S _B — спектральные характеристики красного, зеленого и синего каналов соответственно. Эти ответы отражают эффект цветных фильтров камеры RGB, а также весовые коэффициенты [ r , g и b ]. Спектры длин волн S _c ( λ ) и S _i ( λ ) показаны на рис. 1 (e), а спектральные характеристики трех цветов каналы показаны на рис. S4 (c) (см. дополнительную информацию). Временная автокорреляционная функция эквивалентного источника, Γ _c ( τ ), получается путем преобразования Фурье уравнения.(2),

$$ {\ Gamma} _ {{c}} (\ tau) = {\ Gamma} _ {i} (\ tau) {\ rm {\ circ {v}}} [{\ Gamma } _ {{R}} (\ tau) + {\ Gamma} _ {{G}} (\ tau) + {\ Gamma} _ {{B}} (\ tau)]. $$

(3)

В уравнении. (3) Γ _i ( τ ) — автокорреляция источника освещения и Γ _R ( τ ), Γ _G ( τ ) и Γ _B ( τ ) — автокорреляции, соответствующие спектрам трех цветовых каналов. Символ ⓥ обозначает операцию свертки, а τ относится к временной задержке, сопряженной переменной с ω . Сравнение автокорреляционных функций (действительная часть), рассчитанных для источника освещения и эквивалентного источника cSLIM, показано на рис. 1 (f). Функции построены в зависимости от расстояния d = cτ , где c скорость света в воздухе.

Очевидно, что оптическая задача интерферометрии с использованием цветной камеры эквивалентна использованию трех независимых источников.По сути, хотя комплексные поля из трех спектральных каналов не мешают друг другу, их автокорреляционные функции складываются. В результате новая эквивалентная корреляционная функция (Γ _c ) характеризуется новой огибающей (указывающей время когерентности, обратно пропорциональной спектральной ширине) и фазой (описывающей новую центральную длину волны). Центральная длина волны, обнаруженная в cSLIM, была измерена как λ _c = 558 нм , в то время как падающий белый свет был на λ _i = 589 нм . Длины когерентности, l _c и l _i , измеренные с помощью двух соответствующих автокорреляционных функций [Рис. 1 (f)] составляли 3,24 мкм и 2,26 мкм , соответственно (в воздухе). Мы определяем длину когерентности как полуширину на полувысоте (FWHM) огибающей [пунктирная линия на рис. 1 (f)] автокорреляционной функции.

Для системы cSLIM требуется два шага калибровки. Во-первых, SLM был откалиброван, чтобы гарантировать, что правильное значение φ использовалось для каждого из четырех кадров, что привело к приращению \ (\ pi / 2 \) на центральной длине волны λ _c ⁴⁷ .Это было выполнено путем настройки SLM в амплитудном режиме и измерения амплитудной модуляции в I ( x , y ; φ ) в зависимости от входного напряжения 8-битной шкалы серого SLM ⁴⁷ . Калибровочная кривая для фазы была затем получена путем преобразования Гильберта кривой амплитудной модуляции [см. Раздел S.1 дополнительной информации]. Во-вторых, алгоритм реконструкции фазы SLIM ⁴⁷ включает в себя параметр ослабления α _pc , измеренный экспериментально, который представляет собой коэффициент ослабления падающего света по сравнению с рассеянным светом в фазоконтрастном объективе.Поскольку светопольные объективы не передают это ослабление, эквивалентное ослабление α _bf было введено численно вместо α _pc при реконструкции фазы cSLIM. Правильное значение α _bf было определено путем визуализации ядра неокрашенной тканевой микроматрицы (ТМА) с использованием как фазового контраста, так и объективов светлого поля и настройки α _bf до корреляции между фазовыми значениями от двух приобретений была максимизирована [см. раздел S.2 в дополнительной информации]. Полученное значение α _bf = 3.4 использовалось для всех последующих фазовых реконструкций. Хотя этот коэффициент ослабления был получен для одного неокрашенного ядра ТМА, полученные в результате нормализованные значения фазы неизменно одинаковы для окрашенных и неокрашенных ядер, что указывает на правильную калибровку (см. Раздел «Нормализация эффектов окрашивания»).

Типичные необработанные выходные данные, генерируемые системой cSLIM, показаны на рис.2. Результаты показаны для микроматрицы ткани, окрашенной H & E, на предметном стекле [Рис. 2 (а, г)], керн [рис. 2 (б, д)] и клеточные весы [рис. 2 (в, е)]. Необработанная фаза, ϕ ( x , y ), и микроскопические изображения всего слайда в светлом поле получают за одно сканирование, то есть изображение в светлом поле представляет собой всего лишь один кадр реконструкции cSLIM. Эти возможности сканера cSLIM также показаны в дополнительном видеофайле (Video_S1.mov). Таким образом, ключевой особенностью выходных данных cSLIM является идеальная регистрация стандартной гистопатологии и количественных фазовых изображений. Это важно при проведении исследований QPI с большими когортами, поскольку независимая оценка патологоанатома может проводиться на одной и той же ткани, а не на параллельном срезе. Это гарантирует, что диагноз патологоанатома точно совпадает с маркерами, извлеченными в QPI, без необходимости повторного сканирования среза ткани до и после окрашивания. Таким образом, информация из обоих каналов (фазового и светлого поля) может быть объединена для улучшения результатов задач классификации и сегментации, для которых алгоритмы, относящиеся к обеим модальностям, опубликованы отдельно до сих пор ^8,12,34,48 .Время сканирования для одного ядра (площадь около 1 мм ² ) составляло прибл. 13 секунд, при соотношении пикселей 7,4 пикселей / мкм . Если мы сравним эту скорость сбора данных с таковой у Zeiss Axio Scan.Z1 ⁴⁹ , коммерческого прибора WSI, наш инструмент будет примерно в 4,6 раза медленнее (сканирование области 225 мм ² за 1100 секунд по сравнению с 240 секундами для Zeiss Axio Scan. Z1, с той же частотой дискретизации). Эта пропускная способность замечательна, поскольку cSLIM обеспечивает одновременный доступ как к фазовым изображениям, так и к изображениям с ярким полем, и собирает в 4 раза больше данных за кадр для выполнения фазовой реконструкции (как описано выше).Обратите внимание, что ни один коммерческий WSI не предоставляет стромальную информацию для приложений прогноза. Кроме того, по сравнению с другими методами визуализации без этикеток (например, FT-IR и SHGM) наша система значительно быстрее.

Рис. 2

Выходные данные cSLIM, полученные при сканировании целого предметного стекла микрочипа ткани. ( a — c ) Светлопольные изображения окрашенных H и E тканей всего слайда, одного ядра и эпителиальной области внутри ядра, соответственно. ( d — f ) Необработанные фазовые карты всего слайда, одного ядра и эпителиальной области внутри ядра, соответственно.

Нормализация эффектов окрашивания

Ожидается, что поглощение окрашенной тканью вызовет дальнейшее изменение в эквивалентном спектре cSLIM [показано на рис. 1 (e)]. Кроме того, ожидается, что показатель преломления окрашенной ткани будет отличаться от показателя неокрашенной ткани, поскольку поглощение и показатель преломления связаны через соотношения Крамерса-Кронига ⁵⁰ (см. Дополнительную информацию в разделе S.4 для анализа дисперсии в ткани). В результате фазовые карты, извлеченные из окрашенных и неокрашенных образцов ткани, могут отличаться.Чтобы количественно оценить эту разницу, мы визуализировали ТМА (ТМА-1) биоптатов ткани молочной железы до окрашивания H&E с использованием SLIM и после окрашивания с помощью cSLIM (подробности о ТМА-1 см. В разделе «Материалы и методы»). Необработанные фазовые карты ϕ ( x , y ) для одного ядра ТМА до и после окрашивания показаны на фиг. 3 (a, b) соответственно. Очевидно, что окрашивание приводит к снижению значений фазы, а также контраста изображения. Эти эффекты также показаны на гистограммах двух фазовых изображений на рис.3 (c), где гистограмма окрашенной ткани заметно уже. Чтобы нормализовать эти эффекты окрашивания, мы вычислили для каждого ядра стандартную нормальную переменную Z ( x , y ) из ​​ ϕ ( x , y ), используя уравнение

$$ Z (x , y; {\ lambda} _ {c, i}) = \ frac {\ varphi (x, y; {\ lambda} _ {c, i}) — \ mu} {\ sigma}, $$

(4)

где \ (\ varphi (x, y; {\ lambda} _ {c, i}) = 2 \ pi [n (x, y; {\ lambda} _ {c, i}) — {n} _ {0}] t / {\ lambda} _ {c, i} \) — это измеренная фазовая карта с λ _{c , i} центральной длиной волны обнаруженного спектра, n ( x , y ; λ _{c , i} ) карта показателя преломления ткани, n ₀ показатель преломления среды, окружающей ткань и t толщина ткани раздел гистологии.{2} \) фазовая пространственная дисперсия, а оператор \ (\ langle. \ Rangle \) относится к ожидаемому значению, вычисленному по пространственным координатам ( x , y ). И μ , и σ были вычислены только в области ткани после удаления фоновых пикселей. Подробности об этом вычислении, включая удаление фоновых пикселей, описаны в разделе S.3 дополнительных сведений.

Рисунок 3

Сравнение фазовых карт, полученных с помощью ТМА-1 до и после окрашивания.( a , b ) Необработанные фазовые изображения ядра ТМА до и после окрашивания, соответственно. ( c ) Гистограммы фазовых изображений в ( a , b ). Сходство двух гистограмм количественно оценивается путем вычисления коэффициента корреляции Пирсона ρ между ними. ( d ) и ( e ) Нормализованные карты для одного и того же ядра до и после окрашивания соответственно. ( f ) Гистограммы изображений в ( d , e ).Сходство двух гистограмм количественно оценивается путем вычисления коэффициента корреляции Пирсона ρ между ними. ( г, ) Столбчатые диаграммы, показывающие среднее значение коэффициента корреляции ρ Пирсона между гистограммами ядра для исходных и нормализованных фазовых карт. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение для 30 ядер.

Результаты этой процедуры нормализации показаны на рис. 3 (d – f). Нормализованные фазовые карты визуально очень похожи между окрашенной и неокрашенной тканью, а гистограммы почти полностью перекрываются.Для количественной оценки этого сходства был вычислен коэффициент корреляции Пирсона ρ ⁵¹ между гистограммами окрашенной и неокрашенной ткани до и после фазовой нормализации. Как показано на рис. 3 (c, f), значения ρ значительно улучшились благодаря процедуре нормализации, что указывает на очень высокую степень корреляции. Значения ρ для 30 ядер (15 злокачественных и 15 нормальных, выбранных случайным образом из TMA-1) до и после нормализации приведены на рис.3 (г). Высота столбцов представляет собой средние значения, тогда как столбцы ошибок представляют собой стандартные отклонения для 30 ядер. Высокие корреляции демонстрируют, что карты Z ( x , y ) практически не зависят от пятен, что дает отличные возможности для количественной оценки патологии. Несмотря на вариабельность окраски, связанную с различными пропорциями эпителия и стромы как в ядре, так и в популяции ядер, наш метод нормализации остается надежным.

Это можно вывести из уравнения.(4) это деление на стандартное отклонение удаляет зависимости λ _{c , i} фазовой карты, минимизируя различия между неокрашенной и окрашенной тканью Z ( x , y ) изображения вызванные разными спектрами. Хотя ожидается, что дисперсия в ткани (пространственное изменение как длины волны, так и показателя преломления) вызовет различия между этими изображениями, наш подробный анализ этого явления (включен в раздел S дополнительной информации).4) показал, что эти изменения небольшие. Тот факт, что глобальная нормализация эффективна для устранения эффектов, связанных с пятнами, также указывает на то, что дисперсия в ткани не является доминирующим эффектом (см. Дополнительную информацию).

Сравнение маркеров злокачественных новообразований между окрашенной и неокрашенной тканью

Предыдущие отчеты показали, что маркеры заболевания в количественных фазовых изображениях неокрашенной ткани могут обнаруживать злокачественные новообразования в различных органах ^31,33,34 . Чтобы продемонстрировать, что эти маркеры сохраняются в ядрах окрашенных тканей, отображаемых cSLIM, мы собрали карты Z ( x , y ) как до, так и после окрашивания для 30 ядер в TMA-1, выбранных в предыдущем разделе.Каждое ядро ​​принадлежало отдельному случаю / пациенту с известными результатами диагностики, полученными при оценке патолога. Все злокачественные опухоли были диагностированы как инфильтрирующая протоковая карцинома (IDC). На основе карт Z ( x , y ) мы разработали контролируемый метод обучения для диагностики рака груди, основанный на трех типах характеристик: кривизна средней железы или эпителиального компартмента (ЭК) 〈 C 〉, медиана средней длины рассеяния в пределах EC 〈 l _s 〉 и медианный вектор текстуры для EC 〈 T 〉 ³⁴ .Мы использовали диагноз патологоанатома для каждого ЭК в качестве основы для обучения (подробности см. В материалах и методах). Подробная информация об этапах извлечения признаков, обучения и проверки также включена в раздел «Материалы и методы». Биологическое значение этих трех типов признаков и то, как каждый из них отличается для доброкачественной и злокачественной ткани, уже обсуждалось в ссылке. ³⁴ .

На рис. 4 показаны результаты диагностики окрашенной и неокрашенной ткани.На рис. 4 (a, b, d, e) сравниваются Z ( x , y ) для доброкачественных и злокачественных ЭК до и после окрашивания. И снова изображения в этих двух случаях очень похожи, что доказывает эффективность нашей процедуры нормализации. В cSLIM морфологические детали этих ЭК также доступны для традиционной гистопатологической оценки с помощью изображений в светлом поле [Рис. 4 (г, з)]. Чтобы проверить, могут ли функции, полученные из этих карт Z ( x , y ) обнаруживать злокачественные новообразования в ткани груди, была проведена трехкратная перекрестная проверка, состоящая из трех испытаний.ЭК из всех баз были объединены и разделены на три равных набора, и в каждом испытании два набора использовались для обучения и один набор для проверки. На рис. 4 (g, h) сравниваются значения трех характеристик между неокрашенными и окрашенными ЭК для одной обучающей выборки. Поскольку элемент текстуры 〈 T 〉 является многомерным (материалы и методы), он представлен своим первым главным компонентом на графике. Наши результаты показывают, что значения признаков имеют одинаковое распределение в неокрашенных и окрашенных случаях как для нормальной, так и для больной ткани.

Рисунок 4

Сравнение результатов диагностики окрашенной и неокрашенной ткани с использованием карт Z ( x , y ). ( a , b ) Z ( x , y ) изображения неокрашенного и окрашенного злокачественного ЭК, соответственно ( c ) H & E-окрашенное светлое изображение одного и того же злокачественного ЭК. ( d , e ) Z ( x , y ) изображения неокрашенного и окрашенного доброкачественного ЭК соответственно.( f ) Изображение того же доброкачественного ЭК в светлом поле, окрашенное H & E. ( г, , ч ) Разделение доброкачественных и злокачественных ЭК в пространстве признаков тренировки для окрашенной и неокрашенной ткани соответственно. ( i ) Кривые ROC для трехкратной перекрестной проверки для классификации доброкачественных и злокачественных ЭК.

В каждом случае оценки вероятности для всех ЭК, сгенерированные классификатором линейного дискриминантного анализа (LDA) во всех трех испытаниях, были объединены вместе для создания кривой рабочих характеристик приемника (ROC) для перекрестной проверки (см. Материалы и Методы).Как показано на рис. 4 (i), аналогичная площадь под кривой (AUC) была измерена для анализа как на окрашенной, так и на неокрашенной ткани с использованием карт Z ( x , y ), что указывает на то, что маркеры злокачественности сохраняются. в нормализованных фазовых картах окрашенных тканей. Хотя AUC похожи, они не идентичны. Это можно объяснить тем фактом, что сама морфология ткани (хотя и схожая) не идентична между двумя экспериментами, поскольку процесс удаления покровного стекла с предметного стекла ТМА и его окрашивание приводит к некоторым физическим изменениям в биоптатах ткани.

Сравнение ориентации коллагеновых волокон между окрашенной и неокрашенной тканью

Прогностическая ценность ассоциированных с опухолью сигнатур коллагена (TACS) в ткани груди была продемонстрирована в ряде исследований ^15,52 . Традиционно эти маркеры измеряли с помощью SHGM, который обеспечивает химическую специфичность коллагена. Однако в SHGM край опухоли трудно идентифицировать из-за отсутствия сигналов второй гармоники в центросимметричных структурах, а скорость сбора данных ниже, чем в полнопольной микроскопии из-за геометрии точечного сканирования ³⁵ .Наша группа продемонстрировала в исх. ³⁵ , сравнивая изображения QPI и SHGM одной и той же стромальной ткани, этот QPI позволяет обнаруживать волокна коллагена в биоптатах груди. Хотя сама фазовая визуализация не имеет специфичности к коллагену, волокна коллагена доминируют в соединительной ткани груди, и их морфология может быть обнаружена путем анализа фазовых изображений, как показано в ссылке. ³⁵ . Здесь мы демонстрируем, что измеренный угол θ коллагеновых волокон подобен для окрашенной и неокрашенной ткани после нормализации окрашивания. θ — относительный угол между коллагеновым волокном возле края ЭК и касательной к ближайшей точке на самом крае [Рис. 5 (с)].

Рис. 5

Сравнение относительного угла θ коллагеновых волокон между окрашенной и неокрашенной биопсией ткани. ( a ) и ( b ) Светлопольные изображения злокачественных и доброкачественных ЭК, соответственно. ( c ) Изображение относительного угла волокна θ . ( d , e ) Ориентация коллагеновых волокон в окрашенной ткани в непосредственной близости от злокачественных и доброкачественных ЭК, соответственно.Ориентация волокон показана зелеными линиями, а край EC отмечен оранжевым. ( f ) Нормализованная гистограмма θ , измеренная для всех ЭК в наборе данных окрашенной ткани (15 злокачественных и 15 доброкачественных ядер). Значение p для разделения между двумя классами определялось с использованием T-критерия Стьюдента для двух выборок. ( г, ) и ( ч ) Ориентация коллагеновых волокон в неокрашенной ткани в непосредственной близости от злокачественных и доброкачественных ЭК, соответственно. Ориентация волокон показана зелеными линиями, а край EC отмечен оранжевым.( i ) Нормализованная гистограмма θ , измеренная для всех ЭК в наборе данных неокрашенных тканей (15 злокачественных и 15 доброкачественных ядер). Значение p для разделения между двумя классами определялось с использованием T-критерия Стьюдента для двух выборок.

Для 30 случаев, выбранных из TMA-1 (использованных в предыдущих двух разделах), мы измерили θ на картах Z ( x , y ) как окрашенной, так и неокрашенной ткани с использованием открытого источника. Инструмент измерения волокон на основе MATLAB под названием CurveAlign ¹³ (подробности и спецификации параметров см. В разделе «Материалы и методы»).Учитывались все волокна на расстоянии 63 мкм и от края ЭК. Это находится в пределах диапазона типичной межклеточной сигнальной дистанции, описанной в литературе ^13,53 . ЭК во всех сердцевинах были сегментированы перед вычислением θ , чтобы их клеточные структуры не мешали процессу извлечения коллагеновых волокон (подробности о сегментации ЭК см. В материалах и методах).

На рис. 5 сравниваются полученные результаты между неокрашенными и окрашенными биопсиями тканей.На рис. 5 (а, б) показаны изображения злокачественных и доброкачественных ЭК в светлом поле, а на рис. 5 (в, г, е, ж) показана ориентация волокон в их окрестности. Как видно из этих изображений, значения θ в среднем больше для злокачественной ткани, чем для доброкачественной. Кроме того, ориентация, измеренная на окрашенной ткани, качественно соответствует ориентации, измеренной на неокрашенной. На рис. 5 (e, h) показаны гистограммы θ , измеренные для всех волокон, прилегающих к опухоли, в 30 основных наборах данных. И снова злокачественные ЭК демонстрируют большую вероятность образования больших углов со своими соседними волокнами.Эти измерения согласуются с предыдущими результатами в литературе, где было продемонстрировано, что более высокие значения θ связаны с более агрессивным заболеванием и что выровненные коллагеновые волокна, ориентированные перпендикулярно краю опухоли, способствуют локальной инвазии ¹⁵ . Результаты здесь значительны, потому что параметры на основе коллагеновых волокон показывают аналогичные значения между окрашенными и неокрашенными нормализованными фазовыми картами. Далее мы покажем, что прогностические маркеры, основанные на стромальных волокнах, могут быть оценены с помощью cSLIM на тканях от онкологических пациентов с различными исходами.

Прогноз рака груди с использованием cSLIM — измерение TACS-3

Используя измерение извлечения и ориентации волокон, продемонстрированное в предыдущем разделе, мы измеряем прогностический маркер TACS-3 ¹⁵ . TACS-3 относится к наличию выровненных коллагеновых волокон, которые заканчиваются на краю опухоли при высоких (почти перпендикулярных) значениях относительного угла θ . В Bredfeldt et al . ¹³ , TACS-3 был измерен с использованием автоматизированной контролируемой схемы обучения в пределах TMA, отображаемого с помощью SHGM.Используя cSLIM, мы визуализировали тот же ТМА, окрашенный H и E (TMA-2), и извлекли карты Z ( x , y ) для каждого ядра. Затем мы использовали метод анализа волокна, описанный ранее ¹³ , чтобы продемонстрировать, что cSLIM может успешно обнаруживать TACS-3.

TMA-2 включал 196 случаев (1 ядро ​​на случай) IDC с информацией о безрецидивной выживаемости (DFS) и специфической выживаемости (DSS) для каждого случая ¹⁵ . Используя инструменты количественной оценки волокон на основе MATLAB с открытым исходным кодом CT-FIRE ^13,54,55 и CurveAlign, были вычислены характеристики для каждого волокна, которое находилось на расстоянии 100 мкм от края опухоли (подробности см. В разделе Материалы и методы. по выделению волокна и вычислению признаков).Еще раз, это расстояние было выбрано, чтобы быть сопоставимым с типичными расстояниями межклеточной передачи сигналов, описанными в литературе ⁵³ . Затем элементы, извлеченные из каждого волокна, были объединены для создания вектора характеристик для сердцевины. Было обнаружено, что наиболее информативными для различения пациентов с положительным и отрицательным результатом по TACS-3 оказались три основные характеристики: среднее значение ε (среднее значение ближайшего выравнивания волокна), среднее значение l (ближайшее расстояние волокна от края опухоли) и асимметрия θ .Эти особенности перечислены в таблице на рис. 6 (а). Подробное описание функции см. В материалах и методах, а также в ссылках ^13,54 .

Рисунок 6

Результаты анализа выживаемости для TACS-3 положительных и TACS-3 отрицательных групп, классифицированных на основе характеристик волокон, измеренных на картах Z ( x , y ), полученных с помощью cSLIM. ( a ) Характеристики волокна оказались наиболее информативными при классификации жил на положительные или отрицательные. μ _p и μ _n относятся к среднему значению этих характеристик для групп, классифицированных как положительные и отрицательные, соответственно.( b ) Результаты одномерной регрессии пропорциональных рисков Кокса со статусом TACS-3 в качестве переменной. ( c ) Оценка Каплана-Мейера функции выживаемости для DSS и DFS. Вертикальные метки обозначают события с цензурой справа. Количество ядер, классифицированных как отрицательные по TACS-3, составляло 52, а ядер, классифицированных как положительные по TACS-3, — 144.

Трехмерные векторы признаков для 10 ядер, отмеченных как положительные по TACS-3, и 10 ядер, отмеченных как отрицательные по TACS-3 (на основе по консенсусу патологов ¹⁵ ) были использованы в качестве предикторов для обучения классификатора линейной машины опорных векторов (SVM).Затем классификатор был использован для классификации всех 196 ядер как положительных по TACS-3 или отрицательных по TACS-3. На рис. 6 (а) показана разница в средних значениях признаков для групп, классифицированных как положительные по TACS-3 и отрицательные по TACS-3. Согласно этим средним значениям ядра, классифицированные как положительные по TACS-3, имеют более высокую вероятность содержать выровненные волокна (высокий ε ), которые заканчиваются на краю опухоли или рядом с ним (низкая -1 ). Кроме того, эти ядра имеют гистограммы θ , которые имеют более положительный перекос, отражая асимметрию из-за большего количества случаев высокого θ .Эти измерения согласуются с определением TACS-3 патологами, что свидетельствует об успешной классификации.

Анализ выживаемости был проведен, чтобы проверить, имели ли пациенты, классифицированные как положительные по TACS-3, значительно худшие результаты, чем у пациентов, считавшихся отрицательными по TACS-3. Рисунок 6 суммирует эти результаты. Одномерная регрессия пропорциональных рисков Кокса ⁵⁶ и оценки Каплана-Мейера ⁵⁶ были использованы для сравнения выживаемости между положительными случаями TACS-3 и отрицательными случаями TACS-3. Как показано на рис.6 (b), пациенты с положительным результатом TACS-3 имели отношение рисков ⁵⁶ более 2 и значения p <0,05, что представляет собой статистически значимый шанс худших исходов выживаемости по конкретному заболеванию (DSS) и выживаемости без заболевания (DFS). (см. Определения DSS и DFS в разделе «Материалы и методы»). Эта тенденция также очевидна в оценке Каплана-Мейера функций выживаемости DFS и DSS [рис. 6 (c)], где у пациентов с положительным результатом TACS-3 наблюдается значительно более высокая частота событий. P-значения в этом случае были вычислены с использованием лог-рангового теста ⁵⁷ .

Наши результаты значительны, потому что в дополнение к количественному определению маркера TACS-3 система cSLIM обеспечивает высокопроизводительный сбор данных, работает с существующими окрашенными тканями и обеспечивает одновременное получение цветных изображений в ярком поле.